b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达研究

目的 通过原核表达系统可溶性表达重组D蛋白,为多糖结合疫苗的制备提供蛋白载体.方法 将Hib CMCC株基因组DNA中去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白,经过硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换柱层析纯化后,用Western Blot的方法鉴定其免疫反应原性.结果 表达的重组蛋白以可溶性形式存在,表达量约占菌株总蛋白的44％,经过初步纯化后的重组蛋白可以和Hib抗血清发生特异性反应.结论 成功构建了D蛋白重组表达质粒,并在原核细胞中以可溶性形式表达出具有良好免疫反应原性的D蛋白.     

2011—2012年徐州地区儿童急性呼吸道感染中腺病毒感染特征

目的了解徐州地区儿童腺病毒感染的型别及流行特点。方法采用Real—timePCR方法对2011年1月至2012年12月共990份急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本进行检测;对腺病毒阳性的标本进行常规PCR扩增hexon基因并对扩增产物进行测序分型,同时用Hep-2进行细胞分离。结果990份标本中,Real-timePCR检测腺病毒阳性数为164（16．6％）;腺病毒感染全年散发,其高峰期为3—4月;以7岁以下儿童多见,感染阳性率为91．5％;对其中100例PCR阳性标本扩增产物进行测序分型,涵盖B＼C＼E三个亚种,以HAdVB318株（占18．O％）,HAdVC217株（占17．0％）,HAdVB716株（占16．0％）多见,混合HAdVB3和HAdVB7感染2例;134例PCR阳性标本中分离出毒株59株,分离率为44．0％。结论腺病毒是徐州地区儿童急性呼吸道感染的重要病原,徐州地区腺病毒型别种类多样化,病毒重组变异概率较高,需加强对该病毒的流行监测。     

吉林省2009-2012年肠道病毒71型VP1编码区氨基酸位点的变异分析

目的分析2009--2012年引起吉林省手足口病（handfootandmouthdisease,HFMD）流行的肠道病毒71型（EV—A71）的VP1区氨基酸位点的特征性变异位点。方法对2009--2012年分离于吉林省HFMD病例的70株EV—A71分离株的VPl编码区进行逆转录．聚合酶链反应,然后对扩增产物进行核苷酸序列测定,使用Bioedit软件和MEGA4．0软件分析VPl区氨基酸位点的变异特征以及基因亲缘关系。结果2009--2012年在吉林省分离到的70株EV—A71均属于C4a基因亚型,其中69株与2008年安徽阜阳的分离株亲缘关系最近,并且这69株病毒在VPl编码区第22位氨基酸位点均由谷氨酰胺转变为组氨酸（Q—H）,与2008年安徽阜阳株一致。结论引起2009-2012年吉林省HFMD流行的EV-A71可能：来源于安徽阜阳流行株延续传播。     

CVB32A蛋白酶抑制帽样结构依赖的蛋白翻译

目的探讨CVB3的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译和内部核糖体进入位点（IRES）翻译机制的影响。方法构建表达载体pcDNA3．1—2A,将此表达载体分别与pEGFP—N1、pGL3（F-luc）以及pIRES-GFP载体共转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,检测荧光素酶蛋白的表达。WesternBlot检测CVB3病毒和pcDNA3．1-2A对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响。结果pcDNA3．1之A可以减少帽样依赖的GFP和荧光素酶蛋白的表达,但可以促进IRES依赖的GFP表达。CVB32A基因质粒转染和CVB3感染后,均可发现细胞内elF4G的切割现象;同时CVB3对PABP也有降解作用,而CVB32A基因转染对PABP无明显作用。结论CVB3的蛋白酶2A抑制真核细胞帽样途径蛋白翻译,促进IRES途径的翻译。     

南京95例肝病患者中3种人细小病毒感染的检测与分析

目的 建立人细小病毒B19、人博卡病毒(HBoV)及人细小病毒4(PARV4)分子检测方法,并应用于南京95例肝病患者血浆中三种人细小病毒的感染情况分析.方法 分别建立人细小病毒B19、HBoV及PARV4感染的巢式PCR方法,确定其灵敏度与特异性;并对南京市某医院95例住院肝病患者血浆中三种人细小病毒的感染情况进行检测,并对检测结果进行统计学分析.结果 建立的三种巢式PCR方法特异性好,检测灵敏度均可达10个拷贝.95例肝病患者血浆中检出B19感染2例(2.1％),HBoV感染9例(9.5％),且发现在5例药物性肝炎患者中检出HBoV阳性3例,但未检出PARV4.结论 人细小病毒B19、人博卡病毒(HBoV)及人细小病毒4(PARV4)巢式PCR检测方法灵敏特异.从肝病患者血浆中检出了B19及HBoV.     

2011年湖南省某些地区流行性腮腺炎病毒基因特性分析

目的 了解湖南地区流行性腮腺炎(流腮)病毒流行株基因特性及变异情况.方法 采用Vero/SLAM细胞分离流行性腮腺炎病毒,通过小疏水蛋白基因(SH基因)的序列分析,与其他基因型参考株进行同源性比较,构建亲缘进化树.结果 从2011年湖南多地区上送的16份咽拭子标本中分离到腮腺炎病毒4株,通过基因特性分析,4株毒株均属于F基因型.结论 2011年湖南省流行性腮腺炎的流行株为F基因型,未发现基因型变异.     

潜在的流感大流行病毒:H9N2禽流感病毒

流感是一种由甲(A)、乙(B)和丙型(C)流感病毒引起的急性呼吸道传染病.根据甲型流感病毒的包膜糖蛋白,病毒可以分为1 ～16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型,而这些均可从水禽体内分离出来[1].最近,人们又从蝙蝠的体内发现了H17亚型,但未能成功分离出病毒.按照病毒的致病性来分,可以将所有的H1-16亚型禽流感病毒分为高致病性、低致病性和无致病性禽流感病毒[2].至今为止,人们仅发现H5和H7两种高致病性禽流感病毒.H5、H9和H7等禽流感病毒被证实能够偶尔感染人[3].     

诺如病毒深圳株SZ2010422全基因组序列测定及分析

目的 分析GⅡ-4型诺如病毒深圳分离株SZ2010422全基因组序列,了解其分子结构特点及进化特性.方法 根据New Orleans参考株全序列设计引物,用RT-PCR分段扩增诺如病毒全基因组,经分子克隆、测序后进行系统进化分析及衣壳区氨基酸位点分析.结果 GⅡ-4型诺如病毒深圳SZ2010422株病毒基因组全长7559 bp,病毒基因组分三个开放阅读框(ORFs),ORF1、ORF2及ORF3长度分别为5100 bp、1623 bp和807 bp,ORF1与ORF2之间有19个核苷酸重叠.深圳株SZ2010422基因组核苷酸序列与参考株GⅡ-4型New Orleans变异株同源性最高,全长同源性为99.3％,ORFI、ORF2、ORF3同源性分别为99.5％、99.2％和98.6％.根据系统进化分析,深圳SZ2010422株属于GⅡ-4 New Orleans变异株.通过对衣壳区氨基酸比对,New Orleans变异株位点变化情况为:aa310N或K→S,aa341D→N,aa359T→S,aa396H→P,aa460H→Y.结论 诺如病毒深圳株SZ2010422属于GⅡ-4型New Orleans变异株.     

人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应的研究

目的 探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测人博卡病毒(HBoV) VP2病毒样颗粒(VLPs)诱导特异性细胞免疫反应的最佳条件.方法 HBoV VP2 VLPs免疫小鼠后,用ELISPOT方法检测小鼠的特异性细胞免疫反应,观察不同多肽刺激、不同细胞培养时间、不同细胞浓度以及不同浓度特异性刺激多肽条件下ELISPOT结果.结果 多肽P3(GYIPIENEL)及P5(LYQMPFFLL)刺激HBoV1 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数分别为233个/10(6)和157个/10(6)细胞,P8(GYIPVIHEL)刺激HBoV2 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数为113个/10(6)细胞;培养时间以24 h为最佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(ｒ)的比率分别为232个/10(6)和119个/10(6)细胞;小鼠脾脏淋巴细胞浓度以5×10(5)为最佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为232个/10(6)和108个/10(6)细胞;刺激物浓度10μg/ml为最佳,HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为233个/10(6)和96个/10(6)细胞.结论 HBoV1与HBoV2特异性BABL/c小鼠T细胞表位多肽分别为HBoV1:P3;HBoV2:P8.检测人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应ELISPOT方法最佳实验条件为:培养时间24 h,细胞浓度5×10(5)细胞/孔,刺激多肽终浓度10 μg/ml,可用于HBoV在小鼠上的细胞免疫研究.     

河北卢龙地区猪C组轮状病毒流行状况和VP6基因多样性分析

目的 了解GCRV在我国卢龙地区猪中流行状况和VP6蛋白编码基因的多样性特点,为猪GCRV的深入研究提供依据.方法 采集2007年冬至2008年春河北卢龙地区腹泻和正常猪粪便标本共793份.采用巢式反转录-聚合酶链反应(Nested RT-PCR)的方法对GCRV进行检测,并对测定序列进行同源性和系统进化分析.结果 在793份粪便标本中,GCRV阳性率为16.65％,卢龙地区猪GCRV毒株间同源性差异较大.核苷酸进化树表明,猪GCRV多样性显著.由氨基酸进化分析可知,同一宿主的GCRV氨基酸序列亲缘关系更近.结论 2007-2008年冬春两季,C组轮状病毒在我国卢龙地区猪中感染率较高.VP6基因多样性广泛存在.实验提供的数据为进一步研究猪GCRV的分子流行特征提供了基础.