日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列的预测、 验证与分析

目的 利用生物信息学和实验相结合的方法, 补平已知拼接序列中的缺失片段, 获得日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列。 方法 通过生物信息学方法从已公开发布的日本血吸虫转录组数据库中提取乙醛脱氢酶表达序列标签(EST)序列数据, 与其他物种的同源基因进行多序列联配, 寻找分别与同一蛋白氨基酸序列的N端和C端配对的序列; 设计引物, 用RT?鄄PCR扩增得到全长基因中间的缺失片段并测序。最终获得全长基因序列, 并分析该蛋白的理化性质。 结果 找到日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的可能EST序列片段8条, 对其中的1对EST序列(AAW27891和AAW27047对应的氨基酸序列, 中间缺少约80个氨基酸)进行blastn比对结果, 预测为同一基因的2条片段。根据这两对EST序列设计正、 反向引物, 通过PCR扩增、 对扩增产物进行测序及序列的生物信息学鉴定, 找回了缺少的核酸序列, 并与预测序列大小大致吻合(430 bp)。组合成1条完整的日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的编码序列(提交GenBank, 其登录号为EF503564)。ORF全长为1 596 bp, 编码531个氨基酸, 编码的蛋白相对分子质量理论值为Mr 573 30.7, pI值为7.94,此序列的290～297位氨基酸与乙醛脱氢酶的模式序列［LIVMFGA］-E-［LIMSTAC］-［GS］-G-［KNLM］-［SADN］-［TAPFV］相匹配。 结论 利用生物信息学和实验相结合的方法, 可以补平已知拼接序列中的缺失片段, 获得日本血吸虫乙醛脱氢酶的全长基因编码序列。     

快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条方法的建立与评价

目的 建立一种能区分恶性疟的快速、简便诊断疟疾的胶体金免疫层析试条方法，并对其进行评价。 方法 筛选基于恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记筛选到的单克隆抗体F4H12、G4C9和D8F7，并将其吸附于样品垫；将单克隆抗体B2G10（针对恶性疟原虫与间日疟原虫）和D6A7（只针对恶性疟原虫）分别划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置，制成免疫层析检测试条。用该试条检测疫区非疟疾发热病人血样（107份）和内脏利什曼病患者血样（17份）以评价其特异性，检测确诊的疟疾患者血样（间日疟110份， 恶性疟54份）以评价其敏感性。均用单盲法检测。 结果 检测107份疫区非疟疾发热病人血样和17份内脏利什曼病患者血样，有119份显示为阴性，特异性约为96.0%；其中17份内脏利什曼病患者血样全部为阴性。检测164份疟疾患者血样，阳性153份，敏感性为93.3%，其中间日疟检出率为92.7%（102/110），恶性疟检出率为94.4%（51/54）。 结论 研制出的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高。     

我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体定量蛋白质组学比较分析

目的 应用定量蛋白质组学方法比较我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体蛋白表达的差异。方法 将分离于我国新疆伽师县黑热病患者婴儿利什曼原虫JS5有毒力株前鞭毛体和无毒力株前鞭毛体经酶解后进行液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)的非标记(Label-free)定量分析,利用MaxQuant软件查库,进行Label-free非标定量(LFQ)分析;每个样品重复3次质谱分析,只有1次有LFQ值的蛋白舍弃。结果 本研究共鉴定蛋白3 994个,有毒力和无毒力株间差异蛋白为298个(差异倍数>1.2或差异倍数<0.83,P<0.05),其中利什曼原虫有毒力株前鞭毛体特有表达蛋白15个,无毒力株前鞭毛体特有表达蛋白23个,二者间表达丰度有显著差异蛋白260个,其中有毒力前鞭毛体表达上调蛋白(高表达)78个,表达下调蛋白(低表达)182个。这些差异表达蛋白中已鉴定功能的蛋白分别涉及糖与脂质代谢、核酸代谢、压力反应、细胞骨架形成、细胞周期与增殖等生物功能。结论 利什曼原虫伽师株有毒力株和无毒力株前鞭毛体蛋白质组的表达存在差异,为筛选和鉴定与利什曼原虫感染相关关键分子奠定了基础。     

中华按蚊幼虫溴氰菊酯暴露后应急代谢变化研究

目的　分析实验室溴氰菊酯敏感品系中华按蚊幼虫暴露溴氰菊酯后机体内小分子代谢物变化,为研究中华按蚊溴氰菊酯杀虫剂代谢通路、筛选代谢标志物提供科学依据。方法　测定实验室溴氰菊酯敏感品系中华按蚊幼虫溴氰菊酯半数致死浓度（LC50）和75%致死浓度（LC75）浓度,分别暴露于LC50、LC75浓度下30 min和24 h,运用液相色谱串联质谱（LC⁃MS/MS）技术检测幼虫代谢物种类和含量,分析代谢物变化趋势。结果　溴氰菊酯对中华按蚊溴氰菊酯敏感品系幼虫的LC50和LC75值分别为4.36 × 10⁃3 μg/mL和1.12 ×10⁃2 μg/mL。中华按蚊溴氰菊酯敏感品系幼虫暴露于溴氰菊酯30 min后,LC50、LC75两浓度组差异代谢物主要集中于有机氧化合物、羧酸及其衍生物、脂肪酰基、嘧啶核苷酸等,其中葡萄糖水平在溴氰菊酯接触组中浓度降低;暴露24 h后,差异代谢物主要集中于有机氧化合物、羧酸及其衍生物、脂肪族酰基、嘌呤核苷酸等,其中葡萄糖水平在溴氰菊酯接触组中浓度升高。结论　中华按蚊溴氰菊酯敏感品系幼虫暴露于溴氰菊酯后,代谢产物变化提示糖类和羧酸及其衍生物、脂肪族酰基类、氨基酸及其衍生物可能在溴氰菊酯代谢过程中发挥重要作用。     

Amplification of pfmdr1, pfcrt,pvmdr1, and K13 Propeller Polymorphisms Associated with Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax Isolates from the China-Myanmar Border

Malaria in the China-Myanmar border region is still severe; local transmission of both falciparum and vivax malaria persists, and there is a risk of geographically expanding antimalarial resistance. In this research, the pfmdr1, pfcrt, pvmdr1, and K13-propeller genotypes were determined in 26 Plasmodium falciparum and 64 Plasmodium vivax isolates from Yingjiang county of Yunnan province. The pfmdr1 (11.5%), pfcrt (34.6%), and pvmdr1 (3.1%) mutations were prevalent at the China-Myanmar border. The indigenous samples exhibited prevalences of 14.3%, 28.6%, and 14.3% for pfmdr1 N86Y, pfcrt K76T, and pfcrt M74I, respectively, whereas the samples from Myanmar showed prevalences of 10.5%, 21.1%, and 5.3%, respectively. The most prevalent genotypes of pfmdr1 and pfcrt were Y₈₆Y₁₈₄ and M₇₄N₇₅T₇₆, respectively. No pvmdr1 mutation occurred in the indigenous samples but was observed in two cases coming from Myanmar. In addition, we are the first to report on 10 patients (38.5%) with five different K13 point mutations. The F446I allele is predominant (19.2%), and its prevalence was 28.6% in the indigenous samples of Yingjiang county and 15.8% in samples from Myanmar. The present data might be helpful for enrichment of the molecular surveillance of antimalarial resistance and useful for developing and updating guidance for the use of antimalarials in this region.     

酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

目的 研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性，及其增效机制。 方法 恶性疟原虫氯喹抗性株(Fcc SM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血，经同步化处理，用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%，红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1 ∶ 9，混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬（或氯喹/赛庚啶）组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.312 5～2 560 nmol/L，呈2倍递增。氯喹/酮替芬（或氯喹/赛庚啶）组合药板，是在氯喹药板基础上加入酮替芬（或赛庚啶），每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5 000 nmol/L，呈2倍递增, 每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样 50 μl，37 ℃ 培养 34 h，镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数，计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度（IC₅₀），以及酮替芬（或赛庚啶）提高氯喹活性的指数（AEI）。选择AEI值较高的配伍组，进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用 0～10 h 分别加入酮替芬（或赛庚啶），34 h后检测和计算各时间段IC₅₀及AEI。选择氯喹/酮替芬（或氯喹/赛庚啶）最佳配伍剂量，培养恶性疟原虫 20 h，提取总RNA，用实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因（pfcrt）和多药抗性基因（pfmdr1）表达水平。 结果 0.312 5～2 560 nmol/L氯喹与625 nmol/L 酮替芬（或赛庚啶）配伍，增效作用显著，氯喹/酮替芬的IC50为74.53 nmol/L，AEI为0.42；氯喹/赛庚啶的IC50为89.70 nmol/L、AEI为0.30。5 nmol/L氯喹作用 6～7 h 加入625 nmol/L酮替芬（或赛庚啶），增效作用显著，氯喹/酮替芬的IC50为 67.70 nmol/L、AEI为0.47；氯喹/赛庚啶的IC₅₀为81.53 nmol/L、AEI为0.37。5 nmol/L氯喹与625 nmol/L酮替芬（或赛庚啶）配伍，作用20 h，氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%，而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1 基因表达水平下降14%。 结论 体外氯喹与适量的酮替芬（或赛庚啶）配伍，能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用 6～7 h 加入酮替芬（或赛庚啶）增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1 基因的表达水平有关。     

负载GST抗原的树突状细胞疫苗联合CpG ODN抗日本血吸虫感染的保护性研究

目的研究负载GST抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpGODN)免疫小鼠抗日本血吸虫感染的作用。方法将GST抗原纯化后负载树突状细胞株DC2.4,免疫荧光染色法检测GST的负载情况,并进行动物保护性实验。35只C57BL/6小鼠随机均分7组(每组5只),分别作免疫注射:A组为未处理的DC,B组为牛血清白蛋白(BSA)处理的DC,C组为GST负载的DC,D组为GST+CpGODN共刺激的DC,E组为CpGODN刺激的DC,F组为GST蛋白,G组为空白对照组。A～E各组DC经0.25%胰蛋白酶消化后用PBS调整密度至107/ml,每鼠皮下注射0.1ml,每次间隔2周,共免疫3次。F组首次每鼠免疫50μgGST蛋白加福氏完全佐剂,第2、3次分别免疫50μg、10μgGST蛋白加福氏不完全佐剂,均为皮下注射。各组于末次免疫后10d收集血清,ELISA方法分析血清中的特异性抗体。各组小鼠于末次免疫后2周每鼠经腹部感染尾蚴30±1条。6周后剖杀小鼠,计算减虫率。结果 DC经GST负载后可在荧光显微镜下观察到抗GST的特异荧光,表明抗原已被DC摄取。各组小鼠免疫后,F组抗体水平最高,为2.1270±0.4115,另外C组(0.5552±0.0789)和D组(0.7150±0.0523)的抗体水平均高于G组(0.2358±0.0889),差异有统计学意义(P0.05)。免疫后攻击感染,D组小鼠的减虫率最高为53.3%,其次为F组(24.0%)和C组(21.3%),但D组与两组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 CpGODN联合GST抗原负载的树突状细胞疫苗具有一定的抗日本血吸虫感染作用。     

三苯双脒和阿苯达唑治疗感染旋毛虫小鼠的疗效观察

目的观察三苯双脒和阿苯达唑对感染旋毛虫小鼠的疗效。方法将85只昆明小鼠(每鼠感染旋毛虫幼虫100条)分成3组,A组(成虫期,即感染后5d)、B组(幼虫移行期,即感染后15d)和C组(幼虫成囊期,即感染后35d)。A组小鼠35只,均分为7组,三苯双脒和阿苯达唑各治疗3组,两药给药剂量相同,分别为顿服6.25、12.5和25mg/kg,另设1组为对照组。B、C两组各25只小鼠,各均分为5组,三苯双脒和阿苯达唑各治疗2组,两药给药剂量相同,分别为100和200mg/(kg·d),另各设1组为对照组。A组小鼠治疗后2d处死,计数小肠内成虫。B、C两组小鼠连续治疗7d,治疗结束后15d处死,剖取全部膈肌,消化液消化,镜下计数幼虫。计算各组平均虫数和减虫率,统计分析各组治疗效果。结果A组,三苯双脒各组平均成虫数均显著少于对照组(P0.01),减虫率分别为63.3%、86.2%和98.5%;阿苯达唑6.25和12.5mg/kg组的平均成虫数与对照组的差异无统计学意义(P0.05),但25mg/kg组的平均成虫数则少于对照组(P0.05),减虫率为41.2%。B组,两种药物平均虫数都显著少于对照组(P0.01),三苯双脒治疗组减虫率分别为64.4%和89.6%,阿苯达唑组减虫率分别为56.7%和78.4%。C组,仅阿苯达唑200mg/(kg·d)组的平均幼虫(成囊期)数显著少于对照组(P0.01),减虫率为71.8%,其余各组均无效。结论三苯双脒对小鼠旋毛虫成虫和移行期幼虫有较好的疗效,但对成囊期幼虫无效。较大剂量阿苯达唑对小鼠旋毛虫成虫、移行期和成囊期幼虫均有效。     

按蚊中肠细菌及其应用的研究进展

按蚊中肠细菌能够在控制传疟按蚊种群数量和抑制疟原虫在按蚊体内的发育等方面发挥重要作用。本文从细菌与按蚊的食物关系、按蚊幼虫和成蚊中肠细菌及其应用、细菌在按蚊体内的经发育期传递、细菌与按蚊成蚊的免疫反应,以及利用细菌防控疟疾流行的可行性等方面进行综述。     

日本血吸虫紫外线致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染后的组织细胞反应

目的观察日本血吸虫紫外线致弱尾蚴疫苗（UVC）免疫动物攻击感染后的局部组织免疫病理变化。方法将70只C57BL／6小鼠随机分为疫苗免疫组和感染对照组。疫苗组小鼠接种紫外线致弱日本血吸虫尾蚴后5周,再经腹部皮肤攻击感染正常日本血吸虫尾蚴（800＋50）条;感染对照组经皮肤感染同量尾蚴。于攻击感染后6～120h的不同时间点各剖杀小鼠5只,取攻击部位皮肤及／或肺组织,进行病理学观察。结果UVC疫苗免疫小鼠攻击感染日本血吸虫尾蚴后,皮肤炎症反应较感染对照出现早、反应强烈、持续时间长,EOS百分比高,但肺部出血斑点出现时间（72h）迟于感染对照组（48h）。72～120h,疫苗组小鼠肺部局灶性炎症明显,肉芽肿样结节形成,肺泡壁多正常,而感染对照组小鼠肺组织炎症轻,但肺泡壁水肿明显,且有较多红细胞渗出。结论紫外线致弱尾蚴疫苗免疫增强了小鼠皮肤及肺组织的细胞反应及其杀虫作用。