b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达研究

目的 通过原核表达系统可溶性表达重组D蛋白,为多糖结合疫苗的制备提供蛋白载体.方法 将Hib CMCC株基因组DNA中去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白,经过硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换柱层析纯化后,用Western Blot的方法鉴定其免疫反应原性.结果 表达的重组蛋白以可溶性形式存在,表达量约占菌株总蛋白的44％,经过初步纯化后的重组蛋白可以和Hib抗血清发生特异性反应.结论 成功构建了D蛋白重组表达质粒,并在原核细胞中以可溶性形式表达出具有良好免疫反应原性的D蛋白.     

乙型肝炎与载脂蛋白基因多态性相关性研究

目的 探讨ApoAⅠ-75 Msp1、ApoB-Msp1、ApoCⅢ-Sst1、LRP5、ApoE基因多态性与乙型肝炎血清标志物不同模式之间的内在相关性.方法 将乙型肝炎血清标志物不同模式分为9组,每组80人,共720人份,采用SnaPshot法检测上述基因的多态性,最后用测序法佐证检测结果的准确性.结果 ApoAⅠ-75 Msp1、ApoE基因在乙型肝炎血清标志物不同模式之间差异有统计学意义(P＜0.05),ApoCⅢ-Sst1、ApoB-Msp1、LRP5基因则差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ApoAⅠ-75Msp1、ApoE基因多态性与乙型肝炎血清标志物不同模式有相关性,ApoCⅢ-Sst1、ApoB-Msp1、LRP5与乙型肝炎血清标志物不同模式无相关性.     

丙型肝炎病毒疫苗研究的现状与展望

HCV(丙型肝炎病毒)感染人体后发生慢性化的比例非常高,约有50%的被感染者不能清除病毒,HCV的这种逃避宿主免疫监视,在体内持续感染的原因是很复杂的,主要原因之一在于HCV基因组发生突变的频率较高~([1,2]),每年每个基因位置平均约有1.9×10~3碱基替换,继而在机体免疫系统及药物等选择压力作用下,病毒基因编码的抗原不断发生变异,产生新的HCV准毒株,所以病毒颗粒在体内难以被及时清除.     

人乳头瘤病毒与食管癌病原学关系的Meta分析

目的 探讨人乳头瘤病毒(Human papiuomavirus,HPV)与我国食管癌发生的相关性.方法 汇总了国内有关HPV与食管癌相关的论文,选择采用PCR方法检测的论文对发表的数据进行Meta分析.结果 我们以检测方法为PCR、标本为石蜡包埋标本、论文中列出或提示了引物序列的15篇论文作为入选论文.15篇文献涉及蜡块标本共980份,按照只要检出一个HPV型别即为HPV阳性进行计算,检出阳性例数为460例,各地HPV检出率为8.3%～69.8%,HPV平均检出率为46.9%(95%CI:43.8%～50.0%).在以上980份样品中,检测范围包括了HPV16型的样品有556份,阳性份数为139份,各地检出率为4.4%～63.4%,平均检出率为25.0%(95%CI:21.4%～28.6%);检测范围包括HPV18型的样本有485份,阳性份数为33份,各地检出率为0%～19.0%,HPV18型的平均检出率为6.8%(95%CI:4.6%～9.0%).以上15篇论文中,使用同一引物的文献只有4篇,共检测406份石蜡包埋标本,HPV阳性率为20.3%～67.6%,平均检出率为40.2%(95%17 CI:36.0%～45.4%).结论 我国食管癌组织中有HPV存在,并且HPV感染可能食管癌发生的重要病因.     

甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D蛋白在原核系统中的表达和抗原活性分析

目的研究甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D在原核系统中的表达,并探讨这些蛋白的抗原活性和作为诊断抗原的应用价值。方法采用PCR方法,从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAV16H1上扩增出目的基因,以M47作为表达载体,构建N端带硫氧还蛋白的重组表达质粒。重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用DEAE阴离子交换和镍离子柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western Blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果四个重组质粒经测序证明构建正确无误,在大肠埃希菌中表达四个蛋白的相对分子质量也正确无误。Western Blot分析和间接ELISA方法证实四个蛋白中只有p2a有抗原活性。结论原核表达的P2a蛋白,具有较好的抗原活性,在间接ELISA方法中检测出了所有的24份阳性血清和24份阴性血清,非常有希望做成诊断抗原用于诊断急性甲肝患者和区分甲型肝炎自然感染与注射疫苗所产生的不同免疫。     

丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白的表达及免疫原性测定

目的获得高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白并评价其免疫原性。方法利用原核表达系统,以pET—11d作为载体,在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达获得融合蛋白,之后采用DEAE阴离子交换和镍离子柱亲和层析进行纯化。通过Western Blot验证融合蛋白的抗原活性。同时以该蛋白免疫实验动物后测定血清中的抗体滴度。结果成功获得很高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白,EIA显示融合蛋白能够诱生出高滴度的抗体。结论原核表达系统表达的丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白具有较强的免疫原性,为丙型肝炎病毒治疗性和预防性疫苗的研制提供了一条新的途径。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因点突变对HBsAg抗原性的影响

目的 研究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)常见基因点突变对HBsAg抗原性的影响,了解我国目前常用的HBsAg检测试剂对HBV S基因突变株的检测灵敏性,减少漏检,有效控制乙肝病毒(HBV)感染的传播.方法 构建HBsAg重组野毒株和重组变异株表达质粒,分别将重组野毒株HBsAg表达质粒pSS1adw2及pSS1adr和重组变异株HBsAg表达质粒pSS1adw2-145Arg、pSS1adr-126 Ser和pSS1adr-126 Asn转染COS-7细胞,进行瞬时转染.采用市售HBsAg ELISA检测试剂盒对细胞上清进行抗原性检测.结果 野毒株HBsAg和两种126位变异株HBsAg具有较好的抗原性;145位点突变后、导致HBsAg的抗原性下降.结论 推测是由于145位点变异影响了"a"抗原决定簇的空间结构,从而降低了其与抗-HBs的结合能力.     

人源抗乙型肝炎病毒基因工程全抗体的研制

目的 研制人源化抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体。方法 采用噬菌体抗体库技术,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体pAc-κ-Fc中,转染SF9细胞表达IgG全抗体并进行纯化。免疫荧光检测抗体的表达,竞争抑制ELISA检测其与抗原的结合活性及特异性。结果 获得了一株抗乙肝表面抗原的Fab抗体;在转染后的SF9培养上清中收获到了IgG抗体,竞争ELISA证实该抗体针对HBV表面抗原的特异性抗体。结论 本实验得到了一株人源抗HBsAg的IgG抗体,并进行了纯化。     

乙型肝炎肝硬化患者病毒基因型与特异性、非特异性CTL的关系和意义

目的 探讨乙型肝炎肝硬化患者不同HBV基因型与外周血HBV特异性、非特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的关系和意义.方法 91例乙型肝炎肝硬化患者作HBV基因型检测,比较B、C基因型感染者之间HBV特异性、非特异性CTL的差别,并探讨其临床意义.结果 91例乙型肝炎肝硬化患者中,C基因型55例（60.44%）,B基因型35例（38.46%）,B、C混合型1例（1.1%）,C基因型人白细胞抗原（HLA）-A2阳性27例（49.09%）,HBV特异性CTL（0.18%±0.03%）,B基因型HLA-A2阳性18例（51.43%）,HBV特异性CTL（0.38%±0.04%）,高于C基因型,t=5.01,P＜0.01,非特异性CTL：C基因型（11.87%±1.50%）,B基因型（11.90%±1.51%）,t=0.14,P＞0.05.HBV DNA水平：C基因型[（6.01 ±0.81）log10拷贝/ml],高于B基因型[（5.01 ±0.54）log10拷贝/ml],t=5.01,P＜0.01,丙氨酸转氨酶（ALT）：C基因型（251.13 ±131.11）U/L,高于B基因型（121.25±63.21）U/L,t=3.61,P＜0.01,血清总胆红素（TBil 45.61 ±15.11）μmoL/L,高于B基因型（28.11 ±6.25）μmol/L,t=3.05,P＜0.01.结论 与乙型肝炎肝硬化B基因型感染者相比,C基因型感染者的HBV特异性CTL较低,导致HBV DNA水平较高,肝功能损害较重.     

乙型肝炎表面抗原不同突变体对细胞免疫的影响

目的　研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)不同突变体对细胞免疫的影响。方法　将野生型和变异型HBsAg基因重组质粒NS2 Swt、NS2 S12 6、NS2 S133、NS2 S14 1、NS2 S14 5分别转染CHO细胞,72h收获细胞上清。采用ELISA法检测各组细胞上清preS2 蛋白的表达量。将这些细胞上清刺激PHA活化的人淋巴细胞,MTS法检测不同变异株抗原对淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞分泌IFN γ、IL 10和IL 2的影响。结果　变异和野毒株(wt)各组细胞上清preS2 蛋白的表达量基本一致。变异和wt重组HBsAg刺激T细胞后,其上清MTS显色后的A4 90 值均高于空白组和pCI neo组,说明HBsAg中的蛋白可以促进T细胞增殖;T12 6S氨基酸变异HBsAg能够刺激IFN γ分泌增加;M133T氨基酸变异刺激IL 10分泌增加。结论　这4种乙型肝炎病毒(HBV)变异株感染人体后,机体对它们的细胞免疫反应可能不会有明显的增强或减弱,但也不能忽视T12 6S和M133T变异抗原改变了某些细胞因子的表达,可能对机体细胞免疫造成的潜在影响。