CEA基因沉默对基因工程腺病毒(H101)杀伤食管癌EC9706细胞的影响

目的：研究癌胚抗原（CEA）特异性基因沉默对基因工程腺病毒（H101）杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响，以探讨影响H101敏感性的内在因素。方法：利用RNA干扰技术，构建针对人食管癌EC9706细胞的CEA siRNA载体，通过基因转染，在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系（干扰1组及干扰2组），并以空载体转染和采进行转染的EC9706细胞作对照，用H101在体外进行细胞毒性实验。结果：在此实验任何病毒浓度下，干扰2组与空载体组和对照组比较。生存率明显下降，有统计学意义（P〈0．05）；而干扰1组在低病毒浓度（≤1vp／cell）下，与空载体组和对照组比较，生存率下降，有统计学意义（P〈0．05），当病毒浓度〉1vp／cell时，无统计学意义（P〉0．05）。结论：提示CEA在H1001感染并杀伤肿瘤细胞过程中可能起一定作用，为进一步从基因水平探讨CEA的作用机制和提高瘩瘤腺病毒的治疗效果打下基础。     

MAGE-3基因片段真核表达质粒的构建

目的克隆人MAGE-3基因片段，以构建真核重组表达质粒pcDNA3-1-MAGE-3，为制备以MAGE-3基因片段为基础的核酸疫苗及探讨相关的肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法RT—PCR法从肝癌组织制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的MAGE-3基因片段，pGEM-TEasy为克隆载体，pcDNA3，1为真核表达载体，采用DNA重组技术，将目的基因先克隆至pGEM—TEasy载体再亚克隆至pcDNA3．1载体上，然后，据氨苄青酶素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、克隆鉴定引物T7／SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆pcDNA3．1-MAGE-3中的插入序列进行DNA测序。结果扩增出了MAGE-3目的基因片段；经蓝白筛选实验、克隆鉴定引物扩增方法鉴定得到重组子pGEM—T—MAGE-3；引物扩增方法鉴定得到重组子pcD—NA3，1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较，结果完全一致。结论成功构建了重组pcDNA3．1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗，为肿瘤免疫治疗提供了条件。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

食管癌组织中线粒体DNA突变检测

目的：检测食管癌组织中线粒体DNA(mtDNA)的突变。方法：提取8例食管癌组织的mtDNA；PCR扩增mtDNA的控制区，纯化PCR产物、与T载体连接，转化人肠杆菌，筛选出阳性克隆，用引物T7／SP6做PCR鉴定后测序，与GenRank序列对比。结果：8例标奉mtDNA的控制区共有36个位点发生突变，其中转换32个，颠换4个；同义突变13个，错义突变23个。结论：mtDNA突变很可能在食管癌的发生中发挥一定作用。     

脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β、Fas、p53基因mRNA的表达

目的:研究脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β(polβ)、Fas、p53基因mRNA的表达。方法:采用RT-PCR扩增及半定量分析方法,对22例脑胶质瘤、7例良性脑肿瘤及其相应瘤旁正常脑组织中DNApolβ、Fas、p53基因mR-NA进行检测。结果:与相应瘤旁正常脑组织相比,脑胶质瘤及良性脑肿瘤组织中DNApolβ、Fas基因mRNA高表达,p53基因mRNA低表达(P均<0.01)。脑肿瘤组织中DNApolβ与Fas基因mRNA的表达呈正相关((r=0.611,P<0.05)),与p53基因mRNA的表达无关;p53与Fas基因mRNA的表达亦无关。结论:p53基因mRNA低表达及DNApolβ和Fas基因mRNA高表达与脑肿瘤的发生发展及恶性程度有关。     

转染pcDNA3-hCEA的人树突状细胞对MGC803细胞的作用

目的：观察转染含人癌胚抗原（CEA）真核表达质粒pcDNA3-hCEA的人树突状细胞（DC）对胃癌细胞MGC803的抑制作用.方法：采用细胞因子rhIL-4和rhGM-CSF诱导培养法制备人外周血DC并用Lipofectamine向人DC转染pcDNA3-hCEA.RT-PCR检测转染细胞hCEA的表达,观察DC-hCEA细胞诱导的致敏的T淋巴细胞（CTL）对胃癌细胞MGC803的杀伤效应.结果：DC-hCEA诱导的CTL对胃癌细胞MGC803的杀伤效应强于DC（P＜0.05）.结论：编码CEA基因的真核表达质粒转染的人DC能够诱导较强的特异性抗肿瘤免疫效应.     

海嘧啶对肺腺癌多药耐药细胞A549/T及其亲代细胞的作用观察和机制的初步研究

目的:探讨海嘧啶对肺腺癌多药耐药细胞A549/T及其亲代细胞的生长抑制作用及其抗肿瘤作用机制。方法:应用(mincroculturetetrazolium assay,MTT)比色法和光镜观察等方法,观察A549/T及其亲代细胞在海嘧啶作用后,细胞生长曲线、生长抑制率及形态学等方面的变化。结果:MTT比色结果表明,海嘧啶对A549/T细胞及其亲代细胞具有明显的生长抑制作用,并且在10~100μg/ml剂量范围内存在剂量及时间依赖关系。A549/T细胞在海嘧啶作用12~24 h较亲代细胞敏感(P<0.01),在48 h开始表现出其药物耐受性(P<0.01),在72 h则与亲代细胞间无显著性差异(P>0.05);光镜观察结果发现,A549/T细胞及其亲代细胞的胞质内空泡均明显增多,出现细胞核固缩,或碎裂形成大小不等的核碎片,最后可见细胞死亡后的残骸。结论:海嘧啶对肺腺癌多药物耐药细胞及其亲代细胞均具有明显的生长抑制作用,并可能通过透导肿瘤细胞坏死,从而发挥其细胞毒作用。     

人食管癌Eca-109细胞Mr小于3000膜蛋白肿瘤抗原肽的筛选

目的:寻找被T细胞识别的食管癌细胞抗原肽,为食管癌免疫治疗奠定基础。方法:应用pH3.3的枸橼酸磷酸盐缓冲液间隔24h多次酸洗贴壁生长的Eca109细胞,获得人主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(HLAⅠ)类分子结合的多肽,经超过滤,反相HPLC色谱层析得到不同组分多肽,DC递呈抗原肽刺激特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应,51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞杀伤作用。结果:Mr小于3000的混合多肽经过反相HPLC可获得50多个组分,混合肽、P17、P29和P41组分体外诱导实验表明可以诱导出较强的CTL反应。结论:酸洗法能有效获得HLAⅠ类分子结合的多肽抗原,Mr小于3000的多肽成分中3个组分存在能引起特异性的抗肿瘤CTL免疫反应的肿瘤抗原,具有潜在的免疫治疗作用。     

胃癌组织中CD44V6表达的定量测定

目的:测定胃癌组织中细胞黏附分子CD44V6的表达水平并探讨其临床生物学意义.方法:应用流式细胞分析技术定量分析了96例手术切除的新鲜胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织及20例胃溃疡组织、溃疡旁正常胃黏膜组织中CD44V6的表达水平.结果:4种组织中均有CD44V6的表达,但胃癌组织中CD44V6的阳性率(64.5%,62/96)明显高于癌旁正常胃黏膜组织(27.1%,26/96)、胃溃疡组织(25.0%,5/20)及溃疡旁正常胃黏膜组织(20.0%,4/20),P＜0.05;CD44V6的表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移有关(P＜0.05),且与肿瘤pTNM分期关系密切(P＜0.001).结论:CD44V6高水平表达可能意味着胃癌恶性程度较高且病期较晚,测定胃癌组织中CD44V6的水平对判断胃癌浸润、转移及病期进展情况有一定的诊断价值.     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的生物学特性比较

目的:建立高效脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cell,HUVEC)体外培养方法,与HUVEC株生物学特性进行对比研究,为组织工程及相关医学基础研究提供更好的细胞来源.方法:在新鲜脐静脉内灌注2.5 g/L胰蛋白酶消化获得内皮细胞,内皮细胞培养基(endothelial cellmedium,ECM)进行培养;RPMI1640培养HUVEC株.比较两组细胞形态;免疫组化、RT-PCR检测vWF,CD144的表达;Western Blot检测两组冻存复苏后细胞vWF,CD144蛋白水平的表达.结果:原代HUVEC体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;HU-VEC株胞质多颗粒,细胞单薄.免疫组化原代HUVEC的vWF和CD144表达明显高于HUVEC株[vWF分别为(142.7±3.3),(113.6±0.7);CD144分别为(118.6±0.5),(74.2±0.4);P<0.01].在mRNA水平,原代HUVEC基因CD144(577 bp)的表达量为HUVEC株的(3.15±0.12)倍(P<0.05);vWF(434 bp)表达量为HUVEC株的(6.15±0.37)倍(P<0.05).蛋白水平冻存复苏的原代HUVEC的CD144(135ku)表达量为HUVEC株的(2.07±0.31)倍(P<0.05);vWF(210 ku)表达量为HUVEC株的(5.38±0.23)倍(P<0.05).结论:脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,是组织工程及相关医学基础研究更好的细胞来源.