溶栓素的纯化研究

目的 :研究溶栓素的纯化工艺。方法 :采用超滤法截留分离 ,强阴离子交换层析去除核酸 ,弱阴/阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带 ,纯化倍数为 144 .83,回收率为 38.6 6 %。结论 :溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点 ,具有一定的实用性。     

溶栓素的性质及生物活性研究

目的：研究溶栓素的理化性质、作用机理及其体内溶栓作用。方法：采用不连续系统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定溶栓素的分子量,纤维蛋白平板法测定溶栓素的外活性和研究溶栓素的作用机理,不同温度和pH值下测定体外溶栓作用以确定溶栓素的最适温度和pH值,大鼠颈动脉血栓形成法测定溶栓素的体内溶栓效果。结果：溶栓素的相对分子量对30680,最适温度是45℃,最适pH值为7.8,溶栓素的作用机理与人血纤溶酶相似,有直接纤溶作用,溶栓素的体内溶栓作用在同等剂量的条件下优于尿激酶。结论：溶栓素较适合作溶栓药物。     

溶栓素的纯化研究

目的：研究溶栓素的纯化工艺。方法：采用超滤法截留分离,强阴离子交换层析去除核酸,弱阴／阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带,纯化倍数为144．83,回收率为38．66％。结论：溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点,具有一定的实用性。     

多囊蛋白-1胞内区cDNA的克隆与表达

目的：获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法：用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段,然后插入融合蛋白表达载体pProEXHta中,经测序证实后,转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果：克隆到一个660bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段,得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论：多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。     

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

肝癌特异性单克隆抗体HAb18可变区基因的克隆和序列测定

鉴于基因工程抗体具有分子小、免疫原性低，不被细胞受体结合，在体内成象定位检查时本底低，图像清晰，能进入实体瘤周围微循环，在治疗实体瘤时较完整抗体分子的效能高等优点。我们从肝癌特异性ｍＡｂＨＡｂ１８中克隆了其轻、重链可变区基因，并测定了其核苷酸序列，为...     

诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立

目的 :构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体 ,并将其在Hela细胞中诱导表达 .方法 :用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列 ,克隆入pIND诱导表达载体中。将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后 ,用G4 18和zeocin筛选建系。通过免疫细胞化学染色法 ,确定蜕皮激素A最佳的诱导浓度及诱导时间 ,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察 ,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响。结果 :获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系。免疫细胞化学染色表明 ,30 μmol/L蜕皮激素诱导 5d时目的蛋白表达最强 ,同时观察到Hela细胞的形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 ,并且细胞生长受到抑制。骨架分析进一步显示 ,多核大细胞的骨架发生异常。结论 :活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立 ,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础     

小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建及表达验证

目的构建含有生精细胞特异启动子Dazl的真核报告基因表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag,研究生精细胞特异启动子Dazl在生精细胞中的启动效果。方法通过同源重组的方法对腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag进行改造,构建小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag。在体外,转染GC1-spg野生型细胞和HEK-293T细胞,通过免疫荧光、q-PCR、Western blot验证AAV-Dazl-RFP-Flag在体外的表达特异性。在体内,将AAV-Dazl-RFP-Flag进行腺相关病毒(AAV)包装,通过显微注射技术将AAV注射到小鼠睾丸内,通过q-PCR检测AAV-Dazl-RFP-Flag在体内的表达特异性。结果成功构建了AAV-Dazl-RFP-Flag表达载体,并在体内、外水平验证了AAV-Dazl-RFP-Flag的表达。结论小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag可以在生精细胞中特异性表达,为雄性生殖不育的基因治疗提供更高效的载体工具。     

Internet上分子生物学信息资源的利用

Internet作为全球最大的信息资源库 ,为医学科研和临床工作提供了良好的网络环境、方便的检索工具和大量的相关信息资源。为了更好地利用 Internet上的信息资源 ,本文对 Internet上分子细胞生物学信息的检索和获取途径介绍如下。1　搜索引擎利用通用搜索引擎 (如 YAHOO、AL TA VISTA等 ) ,可以查找到医学、分子生物学方面的信息 ,但这些搜索引擎对于网络资源往往不加选择 ,检索到的信息庞大、误检率较高 ,一般不建议使用这些引擎去检索专业生物医学信息。这里主要介绍几种医学搜索引擎 :1.1　Medsite(http://www.medsite.com/)　 Me…     

肿瘤疫苗的研究现状

肿瘤在体内的排斥/控制主要依赖于肿瘤抗原特异性T淋巴细胞.T淋巴细胞通过TCR与肿瘤细胞表面表达的HLA-抗原肽复合物的相互作用来识别其靶分子.与特异性HLA-抗原肽复合物有价值的相互作用诱导了淋巴细胞克隆的扩增以及一系列的免疫反应.目前,从理论上已经提出了以整个肿瘤细胞,或纯化的肿瘤抗原作为疫苗(包括整个蛋白质分子和抗原肽及纯化的DNA分子)来提高免疫系统对肿瘤的识别和排斥.本文从免疫系统对肿瘤细胞的识别、疫苗诱导的体内抗肿瘤免疫的假设机制、疫苗接种所诱导的抗肿瘤反应以及临床结果几个方面,对当前肿瘤疫苗的研究现状作一简要综述,并对肿瘤疫苗研究中尚待解决的问题作了简单的归纳.