槲皮素对血脑屏障的透过及胶质瘤U251细胞活性的影响

目的 研究槲皮素对血脑屏障(BBB)透过情况及对人胶质母细胞瘤U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 原代培养脑微血管内皮细胞(BMVEC)和星形胶质细胞(AC),建立BBB体外模型,通过电子显微镜和跨膜电阻值(TEER)测量验证BBB模型,采用高效液相色谱(HPLC)检测槲皮素透过血脑屏障的情况.槲皮素处理U251细胞,用MTT观察细胞的生长、TUNEL检测细胞凋亡、彗星电泳(SCGE)分析DNA损伤及流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布情况.结果 透射电镜及TEER鉴定BBB体外模型构建成功,HPLC检测发现槲皮素对血脑屏障的透过率达到65.54%.槲皮素对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用,流式细胞仪检测提示槲皮素作用后,U251细胞阻滞于G2/M期.结论 槲皮素可有效透过BBB,并对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用.     

Heregulin-β1诱导的糖酵解对乳腺癌细胞MCF7迁移的影响

目的 探讨heregulin-β1（HRG-β1）对糖酵解的诱导作用及其诱导的糖酵解在乳腺癌细胞MCF7迁移中的作用。 方法 用PBS （对照组）或HRG-β1处理MCF7细胞12、24和48 h,或HRG-β1+草氨酸盐（oxamate, OX）联用处理MCF7细胞24 h,收集培养基测定葡萄糖消耗量和乳酸生成量,收集细胞用Western blot检测乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）蛋白的表达。用PBS（对照组）、HRG-β1或HRG-β1+OX联用处理MCF7细胞48 h,划痕实验检测伤口愈合率以反映细胞的迁移能力。结果 HRG-β1处理MCF7 细胞12、24和48 h 组的葡萄糖消耗量、乳酸生成量和LDHA蛋白水平增加均在24 h达最大值,与对照组比较差异有统计学意义（ P<0.05）;与HRG-β1诱导组比较,HRG-β1+OX联用组的葡萄糖消耗量差异无统计学意义（ P>0.05）,乳酸生成量降低（ P<0.01）, LDHA蛋白表达量减少（ P<0.05）;MCF7细胞划痕48 h后,对照组和HRG-β1+OX联用组的伤口愈合率相当（ P>0.05）,均低于HRG-β1诱导组,差异有统计学意义（ P<0.001）。结论 HRG-β1通过上调LDHA诱导糖酵解从而促进乳腺癌细胞MCF7的迁移。     

槲皮素、芦丁及葛根素抑制LDL氧化修饰作用的研究

目的：研究黄酮类中药槲皮素、芦丁及葛根素抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化修饰的作用。方法： 按一次性密度梯度超速离心法分离人血清LDL,分别加入5.0 μmol·L^-1槲皮素、芦丁及葛根素与LDL温育3 h,然后利用Cu²⁺介导体外氧化修饰脂蛋白的方法,观察LDL氧化修饰不同时间,其A₂₃₄,相对电泳迁移率（REM）,硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）及载脂蛋白羰基含量的动力学改变,并与对照组比较。结果：Cu²⁺介导LDL氧化修饰时,在2,4,6,8,12,24 h后,其A₂₃₄,REM,TBARS及载脂蛋白羰基含量均逐步增加；加入5.0 μmol·L^-1槲皮素、芦丁及葛根素的实验组,Cu²⁺介导LDL的氧化修饰分别延迟2～6 h,2 h和2 h,其A₂₃₄,REM,TBARS及载脂蛋白羰基含量较对照组降低；槲皮素实验组分别较对照组降低27.7%～49.6%,24.1%～38.6%,19.8%～34.3%及36.4%～56.8%；芦丁实验组分别降低12.8%～39.3%,15.7%～32.0%,19.0%～28.1%及12.8%～50.3%；葛根素实验组分别降低3.3%～19.2%,7.0%～22.5%,19.5%～22.8%及8.6%～47.0%。结论：槲皮素、芦丁及葛根素均可抑制Cu²⁺诱导的LDL的氧化修饰,且槲皮素的抗氧化作用较芦丁及葛根素强。     

人VIGILIN的shRNA真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞周期影响的初探

目的构建靶向人高密度脂蛋白结合蛋白(VIGILIN)的shRNA真核表达载体,并初步探索VIGILIN与人肝癌细胞系HepG2细胞周期是否有关联。方法构建人VIGILIN的shRNA重组质粒,并将重组质粒pSIREN-VIG转染HepG2细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞VIGILIN mRNA和蛋白的表达,并用流式细胞术检测细胞周期是否有所改变。结果1HepG2细胞转染pSIREN-VIG后,VIGILIN的表达被特异、有效地抑制。转染48h后,VIGILIN的表达从mRNA和蛋白的水平都有明显的减少;2VIGILIN表达抑制后,G2/M期细胞所占比例增加:相对于三个对照组(未转染组2.4%,脂质体转染组4.9%和转染pSIREN-GFP组6.5%),实验组(转染pSIREN-VIG组)G2/M期细胞增加到9.4%。结论我们成功的构建了能特异、有效的抑制人VIGILIN表达的shRNA表达质粒,人VIGILIN能够影响到细胞周期的正常运行,导致G2/M期阻滞。     

洋葱黄酮类物质对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察两种不同提法的洋葱黄酮类物质对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用热水浸提法和乙醇抽提法从洋葱中提取黄酮类物质,MTT法测定其对人结肠癌细胞HCT116增殖的影响,免疫细胞化学染色检测Caspase-3蛋白的表达,TUNEL法观察细胞凋亡,并通过基因组DNA电泳观察凋亡特征性“梯状“条带。结果:MTT法结果显示两种不同方法提取的黄酮类物质对HCT116细胞的增殖均有抑制作用,呈现时间和剂量依赖性,而热水浸提法和乙醇抽提法相比,后者提取的物质抑制作用优于前者,发挥作用的起始浓度也较低;基因组DNA琼脂糖凝胶电泳显示黄酮类物质作用于HCT116细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带;免疫细胞化学染色和TUNEL结果均表明在一定药物浓度作用后,细胞出现凋亡。结论:洋葱中的黄酮类物质对体外培养的人结肠癌HCT116细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导的作用,其中乙醇抽提法提取的黄酮类物质作用更强。     

洋葱黄酮类物质对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影晌

目的:观察两种不同提法的洋葱黄酮类物质对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响.方法:采用热水浸提法和乙醇抽提法从洋葱中提取黄酮类物质,MTT法测定其对人结肠癌细胞HCT116增殖的影响,免疫细胞化学染色检测Caspas-3蛋白的表达,TUNEL法观察细胞凋亡,并通过基因组DNA电泳观察凋亡特征性"梯状"条带.结果:MTT法结果显示两种不同方法提取的黄酮类物质对HCT116细胞的增殖均有抑制作用,呈现时间和剂量依赖性,而热水浸提法和乙醇抽提法相比,后者提取的物质抑制作用优于前者,发挥作用的起始浓度也较低;基因组DNA琼脂糖凝胶电泳显示黄酮炎物质作用于HCT116细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带;免疫细胞化学染色和TLINEL结果均表明在一定药物浓度作用后,细胞出现凋亡.结论:洋葱中的黄酮类物质对体外培养的人结肠癌HCT116细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导的作用,其中乙醇抽提法提取的黄酮类物质作用更强.     

重组人脑髓鞘碱性蛋白及其抗体的制备与研究

背景：中枢神经系统髓鞘中蛋白部分的1/3为髓鞘碱性蛋白,作为一个蛋白质家族在人脑中有4种分子形式. 目的：探讨重组人脑脊髓碱性蛋白表达及其免疫学的功能. 设计：单一样本研究. 单位：四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室. 材料：实验于2003-08/2004-03在四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室完成.人脑hMBP相对分子质量为21500,T4DNA Ligase,小牛肠碱性磷酸酶,RNase,PEG8000等,硝酸纤维滤膜,抗人脑髓鞘碱性蛋白ELISA试剂盒. 干预：①采用EcoR1和BamH1酶切人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA克隆片段.②重组表达载体p5TMP的构建及转化.③重组表达载体转化菌的生长及其诱导表达.④重组hMBP抗体制备. 主要观察指标：①蛋白表达产物的检测与鉴定;②人脑hMBP抗体检测与鉴定. 结果：①分别有4999bp pGEX-5TDNA和557bp人脑髓鞘碱性蛋白插入片段.②原对照质粒一条浓区带消失,而重组体有特异蛋白质区带出现.相对分子量为42000.③5次注射人脑髓鞘碱性蛋白后抗体效价达到1/16,并证实其hMBP抗原特异性. 结论：本文构建了含相对分子为21500人脑髓鞘碱性蛋白外显子Ⅰ-Ⅶ编码序列的表达载体,还成功制备了重组人脑髓鞘碱性蛋白抗体.     

人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 克隆人脑源性神经营养素－6（neurotrophin-6,NT-6)基因，并观察其在大肠杆菌中的表达情况。方法 从流产胎儿大脑皮层提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT－6基因cNDA片段；经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒，构建NT－6的表达载体。通过诱导，使NT－6基因在大肠杆菌中表达。结果 分离克隆了人脑源性NT－6基因，含该基因的大肠杆菌在异丙基－β－D－硫代半乳糖苷诱导的情况下，表达了特异性的蛋白质。结论 人脑源性NT－6基因的克隆表达为进一步研究NT－6的结构，功能及临床应用奠定了基础。     

中国人内源性高甘油三酯血症患者ATP结合盒转运子A1基因R219K多态性研究

目的研究ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette A1,ABCA1)基因R219K多态性是否与中国人内源性高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)有关联,为探讨本病的分子遗传基础提供依据。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法,对成都地区309名汉族人(200名正常人和109例内源性高甘油三酯血症患者)ABCA1基因R219K多态性位点进行分析。结果中国人ABCA1基因R219K多态位点K等位基因频率在对照组和HTG组分别为0.472与0.436;HTG组和对照组R219K位点之间基因型和等位基因的频率差异无统计学意义。对照组和HTG组KK基因型携带者血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)水平均较相应组RR基因型携带者显著升高[(1.48±0.45)mmol/Lvs(1.27±0.29)mmol/L,P<0.05;(1.07±0.30)mmol/Lvs(0.87±0.19)mmol/L,P<0.05];对照组RK型携带者血清甘油三酯水平较RR型携带者显著降低[(1.22±0.37)mmol/Lvs(1.41±0.84)mmol/L,P<0.05],HTG组血清甘油三酯在RR、RK、KK型之间有逐渐降低的趋势[(3.82±2.02)mmol/Lvs(3.42±1.67)mmol/Lvs(3.33±1.43)mmol/L,P>0.05];HTG组K等位基因携带者(RK或KK型者)总胆固醇(totalcholesterol,TC)/HDL-C比值均较RR型携带者显著降低(KKvsRKvsRR4.82±1.28vs5.42±1.62vs6.33±1.70,P<0.05)。结论ABCA1基因R219K多态性不仅与中国成都地区正常汉族人血清HDL-C、甘油三酯含量有关,而且还与内源性高甘油三酯血症患者血清HDL-C水平、TC/HDL-C比值相关联。     

肥胖者HDL亚类组成与载脂蛋白E基因多态性的关系

目的：探讨肥胖者血清载脂蛋白E基因多态性与HDL亚类组成的关系。 方法： 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性和双向电泳-免疫印迹检测法，分析93例肥胖者和96例非肥胖者者的apoE基因型、HDL各亚类组成及相对含量。 结果： 肥胖组和对照组apoE基因型及等位基因频率分布均以E3/3和ε3最高。肥胖者等位基因ε2携带者血清apoE/CⅢ、HDL2a较等位基因ε3和ε4携带者升高，而apoB100、apoCIII、HDL3c则较ε3携带者下降，差异显著（P<0.05）。对照组中等位基因ε2携带者血清TC、apoE较等位基因ε3携带者升高，等位基因ε2携带者HDL3b较等位基因ε3携带者降低，差异显著（P<0.05）。 结论： apoE 基因多态性与HDL亚类的组成和分布相关,ε2等位基因有减缓肥胖者HDL颗粒变小的作用。