SMAD3在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达与分布

目的：研究SMAD3在瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid fibroblast,KFB)和正常人皮肤成纤维细胞（Normal skin fibroblast,NFB)中的表达和分布。方法：采用Western蛋白印迹法和细胞内免疫荧光法测定SMAD3的表达和分布。结果：SMAD3在KFB和NFB两种细胞中的表达差别不大（P＞0．05），KFB核内的荧光强度强于NFB。结论：SMAD3在KF3细胞核内的分布高于NFB。     

许旺细胞增殖能力与基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原影响的关系

背景许旺细胞对周围神经的再生起着非常重要的作用,细胞外基质对许旺细胞生长也起着重要的作用.目的了解基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原对体外培养条件下许旺细胞的贴壁及增殖作用的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照重复观察测量.单位解放军第四军医大学医院整形外科实验室.对象实验于1995-01/04在第四军医大学西京医院整形外科实验室完成.许旺细胞由新生日本大耳白兔制备获得.方法用基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原包被培养板,以结合了相应抗体的培养板及包被Ⅰ型胶原和多聚赖氨酸的培养板为对照,将培养的许旺细胞以相同浓度加入各组培养板内.测定2,6,24 h细胞贴壁率,培养72 h进行3H-TdR掺入试验,双道液体闪烁计数器测定各组的放射性计数.主要观察指标①细胞贴壁率计算结果.②3H-TdR计数结果.结果培养2 h基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原组早期贴壁率分别为66%和59%,较Ⅰ型胶原组(45%)和多聚赖氨酸组(43%)高,抗基膜粘连蛋白和抗Ⅳ型胶原组贴壁率较低.基膜粘连蛋白组、抗基膜粘连蛋白组、Ⅳ型胶原组、抗Ⅳ型胶原组、Ⅰ型胶原组、多聚赖氨酸组3H-TdR掺入试验计数分别为(10.0±2 7)×103,(1.3±0.3)×103,(10.4±2.4)×103,(1.4±0.5)×103,(5.8±2.7)×103,(3.3±1.0)×103 min-1.基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原组3H-TdR掺入量高于其他组.结论基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原对体外培养条件下的许旺细胞贴壁及增殖有促进作用,为发挥许旺细胞在神经组织工程中的作用奠定了实验学基础.     

使用人骨钙素启动子实现在体研究成骨细胞特定基因的功能

目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体。方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成。以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子。将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc。将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物。DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致。pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显著降低,剔出效率约为69.8%。结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础。     

暂时性腹腔关闭材料及技术在腹壁缺损中的应用

背景：腹壁缺损是外科治疗的难题之一,设法一期关闭腹腔是外科医生的一项挑战,随着损伤控制外科理念的发展,各种暂时性腹腔关闭技术及材料的出现为该难题提供了有效的治疗方案。目的：综述暂时性腹腔关闭材料及技术在腹壁缺损中的应用现状。方法：应用计算机检索Pubmed数据库（1986/2010）,以＂abdomen,abdominal wall,abdominal injuries/surgery,laparotomy,temporary abdominal closure,patch,vacuum-assited closure,wound healing＂为检索词;应用计算机检索中国知网数据库（2005/2010）,以＂腹部、腹壁、损伤、剖腹术、暂时性关腹、补片、封闭负压引流、创面愈合＂为检索词。计算机检索得到278篇文献,排除因研究目的与此文无关,观点落后,重复及类似的研究,保留31篇。结果与结论：暂时性腹腔关闭在腹壁缺损中已成为一项重要的治疗手段,对改善愈后,提高治愈率有积极的意义。目前应用于暂时性腹腔关闭的材料及技术种类较多,各有利弊及适应证、对于选用何种材料、术式需根据治疗原则及具体病情而定。     

皮肤撕脱伤动物模型中整合素CD18的动态表达及其变化规律

目的:研究整合素CD18在皮肤撕脱伤动物模型中的表达规律,探讨其在组织继发性坏死中的作用。方法:复制皮肤撕脱伤动物模型,分别于0,2,6,12,24h采集组织标本,用PCR反转录扩增的方法检测组织中CD18mRNA,进行半定量测定,了解其随时间的变化规律。结果:①撕脱组中CD18mRNA的含量随撕脱时间的延长而升,12h左右达峰值,此后随时间的延长而略有下降。②撕脱组中CD18mRNA的含量明显高于对照组,统计分析二者差异显著。结论:黏附分子CD18在皮肤撕脱伤早期,表达明显增高,其高表达可能是早期造成撕脱皮瓣继发性坏死的重要原因之一,为临床皮肤撕脱伤的救治和康复提供理论依据。     

新型非病毒纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究

探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性，安全性、转染效率，转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较。方法：以血管内皮细胞生长因子(VEGF165)为目的基因，构建真核表达载体pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165,分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF。转染鼠成纤维细胞(3Y1)，转染4h后镜下观察细胞转染后表型变化，24、48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率，通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位。MTT法检测对转基因细胞的毒性。ELIsA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况。结果：经G418筛选后的阳性细胞克隆，为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型。免疫组织化学证实pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165在转基因的细胞中呈高表达，定位于胞浆。Western Bldt结果显示纳米微囊转染3Y1细胞48h后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达。免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相应浓度的阳离子脂质体，转染4h后镜下观察细胞表型显示10mM浓度纳米微囊有较高的毒性。MTT测定示纳米微囊对3Y1细胞有显著的抑制增殖作用并随浓度梯度变化，ELISA检测发现纳米微囊、脂质体组培养上清中VEGF蛋白表达水平可维持4周，但纳米微囊组随时间变化而下降，瞬时表达水平高于脂质体组。结论：纳米微囊转基因载体作为一种新型非病毒载体，具备基因治疗应用潜能，可能为血管重建基因治疗提供了一种新的模式。     

机械应力对培养人皮肤成纤维细胞增殖细胞核抗原的表达的影响

目的：研究牵拉幅度为40％的单次持续牵拉作用于培养的人皮肤成纤维细胞对细胞增殖影响。方法：体外培养人正常皮肤成纤维细胞，将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上，待细胞贴壁达75％-80％融合时，实施40％单次持续牵拉，用WESTERN-BLOT对牵拉组与非牵拉组48h的增殖细胞核抗原（PCNA）表达进行检测。结果：牵拉组PCNA可见阳性表达而对照组结果呈阴性。结论：单次40％持续牵拉可以引起细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达，应力可以促进细胞增殖。     

创面修复与去神经支配大鼠皮肤创面上皮神经激肽1受体细胞的表达

目的:研究创面愈合过程中神经激肽1受体在创面周边新生上皮细胞的表达及与创面愈合的关系.方法:实验于2002-01/04在第四军医大学神经生物教研室完成.20只新生SD大鼠采用随机数字法分为两组,每组10只.去感觉神经支配组皮下注射辣椒素破坏皮肤感觉神经纤维,制成失感觉神经模型,另一组为对照组.两组均在臀部制作圆形皮肤缺损,并各从中单纯随机抽样选5只分别在一定时间点沿创面周缘及底部取材,进行神经激肽1受体的免疫组织荧光染色及苏木精-伊红染色,观察其时空分布规律;另外5只在相应时间点测量残留创面面积,对结果进行分析比较.结果:正常大鼠与皮肤去感觉神经大鼠在创面愈合中创面周边新生上皮细胞均有神经激肽1受体表达;损伤后神经激肽1受体表达阳性的上皮细胞增多,胞体增大,呈增殖旺盛表现;神经激肽1受体在去感觉神经大鼠上皮细胞的表达较正常对照高;去感觉神经大鼠与正常大鼠相比,创面愈合速度较慢.结论:大鼠皮肤神经激肽1受体表达与创面愈合之间关系密切,由感觉神经末梢所释放的P物质等神经肽类递质可能是调节促进创面愈合的重要因素.     

组织工程血管的种子细胞

血管移植物数量和功能的不足制约着许多疾病的治疗，因此组织工程血管成为研究的热点。种子细胞作为组织工程血管重要组成部分，如何达到正常血管内皮细胞及平滑肌细胞的生理功能，是人们关注的焦点。干细胞因具备多向分化潜能，被视为理想的种子细胞，然而干细胞种类较多，在组织工程血管的构建过程中，哪种干细胞更适合作为种子细胞，尚无定论。文章对造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等多种干细胞进行比较，简述各自的特点，试图全面了解干细胞的功能，为进一步实验奠定一定的基础。     

细胞因子诱导的imDCs鉴定及免疫学功能研究

目的:分析未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)的免疫学功能,诱导同种异体复合组织移植局部免疫耐受性.方法:采用细胞因子诱导培养黏附法,取大鼠骨髓前体细胞,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4细胞因子诱导下培养7 d,收集贴壁细胞光学显微镜观察imDCs的形态学特征,用质量分数2%锥虫蓝染色检测活性细胞率;应用流式细胞仪分析imDCs表面标志分子;MTT比色法测定imDCs与同种异体T淋巴细胞混合培养后T淋巴细胞的增殖能力.结果:制备诱导培养的imDCs具有形态不规则、表面粗糙层叠状皱褶、胞质突起短而多、树枝样分又明显等典型形态特征;活性细胞率高达93%;表面较特异标志分子OX62为(61.08±4.86)%,OX62阳性细胞表达CD80、CD86、组织相容性复合体-Ⅱ表达率分别为(3.56±0.73)%、(5.38±1.09)%、(6.45±0.74)%,均为较低表达;imDCs对同种异体T淋巴细胞基本无刺激增殖能力.结论:用细胞因子诱导培养黏附法取骨髓前体细胞,可较快分选出活性和纯度较高,数量足够的imDCs,为同种异体复合组织移植诱导免疫耐受防止排斥反应的研究奠定良好的基础.