用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

慢性乙型肝炎抗病毒药物临床应用现状

<正>近年来国内外对慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒药物治疗已有了很大进展,主要采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和防止慢性化发展等综合治疗,在其治疗原则上,国内外肝病学界已达成共识,认为抗病毒治疗是其中最主要、最根本的治疗措施[1]。由于现代分子生物学与基因治疗的快速发展,又为慢性乙肝抗病毒治疗相关研究提供了新的机遇与挑战。大量临床研究证明,乙肝病     

重组人肿瘤坏死因子α的抗病毒活性

本文旨在进一步了解重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)的生物学活性。首先在大肠杆菌中克隆出编码TNE-α的基因:裂菌,进而用一系列层析技术从不溶性物质中将TNF-α纯化至均一程度。重新折叠变性蛋白,该重新折叠的TNF-α在小鼠L929细胞上的溶细胞作用达1×10~7U/mg。4℃保存TNF-α。检测按Spofford的改良方法将小鼠L929(获自ATCC,CCl-1)或Hela细胞分别以12500或20000细胞/孔种于96孔平底微滴板上。培养24小时,加入TNF-α,继续培养48小时后,细胞溶解,用0.5%结晶紫溶液染色观察结果。对照细胞仅用培养基,以细胞溶解50%为1个单位。用标准细胞致病作用(CPE)测定抗病毒活性。用TNF-α处理Hela细胞,以脑心肌     

用双拷贝逆转录病毒载体转导人G－CSF cDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆位点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证明嵌合的目的基因在感染细胞中通过基因复制而转染到５＇ＬＴＲ的转录单位之外并且在染色体ＤＮＡ中稳定整合，复制产生两个拷贝，在３＇ＬＴＲ和５＇ＬＴＲ中各有一个基因。     

用斑点杂交法检测干扰素制剂中的EBV-DNA

类淋巴母细胞(Namalwa)干扰素(IFN)在理化特性和抗原性方面与人白细胞相似,是目前自然干扰素的主要来源之一,但Namalwa细胞是个瘤株,每个细胞中含1～2个EBV基因组,用这种细胞产生的干扰素制剂可能存在一定的致癌危险性。本文采用分子杂交法检测,报道如下。     

快速筛选单克隆抗体的新方法——微棒放射免疫测定法

本文介绍一种敏感、快速、简易的筛选单克隆抗体的新方法——微棒(Microstick)放射免疫测定法。本试验装置由96孔微量板和96根以8×12排列的微棒、洗涤盘、微棒断头器和收集器支架等组成。操作时先将微棒浸入含2～600μg/ml经亲和纯化的抗-鼠IgG的洗涤盘     

人干扰素微量测定方法的研究

干扰素(IFN)的各项研究,都离不开对其效价测定,且工作量较大。因此,这就迫切需要研究建立一种快速、简便、敏感、稳定而又经济的微量测定方法。国外各主要实验室对IFN测定不仅早已微量化,而且有些实验室已经实现“微量—自动化”(用电     

用蓝色琼脂糖CL-6B配体亲和层析IFN-γ和IL-2的实验研究

由美洲商陆(PWM)诱导人脾细胞产生γ干扰素(IFN—γ),再经蓝色琼脂糖CL-6B线性梯度柱层析、一步纯化可将IFN-γ和IL-2洗脱成2个组份。IFN-γ生物活性回收率为770%,比活性达7×10~6IU/mg蛋白.纯化倍数为2682倍.IL-2活性在IFN-γ活性峰前洗出.IFN-γ除在0.5～0.8MNaCl PB洗出一主峰外,用50%乙二醇(EG)+50%IMNaCl也可洗出一个较小的活性峰.由提高离子强度纯化IFN-γ可提示.IFN-γ与蓝色琼脂糖CL-6B是靠离子键结合的.     

双向电泳分析CCR5对二氢叶酸还原酶表达的抑制作用

目的:采用双向电泳为基础的蛋白质组学的研究手段,发现趋化因子受体5被配体激活后的功能相关蛋白质.方法:构建稳定表达CCR5的HEK-293细胞株.用RANTES刺激12 h后,用双向电泳方法进行分析.在以PDQuest图像分析软件进行分析后,对表达有差异的蛋白质进行MOLDI-TOF MS/MS质谱鉴定,并对鉴定的蛋白作RT-PCR初步分析.结果:流式细胞仪检测结果表明HEK-293细胞稳定表达CCR5,在受RANTES刺激后作双向电泳分析并经质谱鉴定后,发现二氢叶酸还原酶表达降低,与RT-PCR检测结果相一致.结论:经蛋白质学组方法分析,发现CCR5被其配体RANTES激活后抑制了二氢叶酸还原酶的表达.     

CCR5与 HIV-1感染的分子机制研究进展

趋化因子受体5(CCR5)作为一个辅助受体在HIV-1进入巨噬细胞的过程中发挥重要作用.在不同人种中,CCR5存在天然的突变基因型,其中包括纯合子和杂合子基因型,它们对HIV-1的易感性也各不相同.实验室中膜外袢的点突变、缺失突变、插入及膜内基元的信号转导研究从分子水平揭示了一些氨基酸和空间结构对辅助受体的功能起关键性的作用,这对深入了解HIV-1与受体作用的分子机制,为寻找有效的阻断途径无疑是必需的和重要的.