人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

多肿瘤标志物蛋白芯片检测中CA125对恶性肿瘤的诊断价值

  目的  探讨多肿瘤标志物蛋白芯片中糖链抗原CA125对恶性肿瘤的诊断价值。  方法  收集第三军医大学大坪医院可供分析的25 076例多肿瘤蛋白芯片检测结果,分析CA125在不同人群、不同肿瘤中升高情况,以及CA125升高伴随其他检测指标升高在肿瘤中的分布情况。  结果  CA125在恶性肿瘤患者中明显高于良性病变患者及正常体检者,而且卵巢癌最高（51.92%）,其次为胰腺癌（49.25%）和肝癌（42.56%）;同时升高的指标以CEA最为常见,其次为CA199、CA242和Ferritin,CA125/CEA同时升高最常见于结直肠癌（83.87%）,其次为乳腺癌（59.72%）,CA125/CA199同时升高最常见于结直肠癌（90.97%）和胰腺癌（78.63%）,CA125/CA242伴随升高最常见于结直肠癌（92.26%）和胰腺癌（74.81%）,CA125+CEA+CA199及CA125+CEA+CA199+CA242升高均最常见于肺癌。  结论  CA125单项指标升高对卵巢癌、胰腺癌及肝癌的诊断有较高的价值,CA125伴随或联合CEA、CA199、CA242检测有利于提高结直肠癌、胰腺癌、肺癌的诊断阳性率。      

多肿瘤标志物蛋白芯片对泌尿系肿瘤和男性生殖系肿瘤诊断的临床价值

目的：探讨多肿瘤标志物蛋白质芯片在泌尿系肿瘤和男性生殖系肿瘤诊断中的临床应用价值,并建立12项肿瘤标志物联合诊断泌尿系和男性生殖系肿瘤的函数。方法：采用C-12多肿瘤标志物蛋白质芯片检测57例泌尿系肿瘤患者、38例男性生殖系肿瘤患者、11例泌尿系良性病变患者、25例男性生殖系良性病变患者,以及1203例正常体检者。所有患者均经病理学、影像学或临床确诊。结果：用C-12芯片检测泌尿系肿瘤的灵敏度是49.12%,特异度是81.81%,阳性预测值是93.33%,阴性预测值是23.68%;男性生殖系肿瘤的灵敏度是62.16%,特异度是48.00%,阳性预测值是64.86%,阴性预测值是46.15%。除前列腺癌外,C-12芯片联合检测的阳性率在泌尿系肿瘤和其他男性生殖系肿瘤中显著高于单项肿瘤标志物的检测（P〈0.05）。建立的诊断判别函数对肾癌、膀胱输尿管肿瘤、前列腺癌、睾丸癌的诊断准确率分别为81.3%、94.5%、94.0%、91.0%,显著高于单项标志物检测（P〈0.01）。结论：除前列腺癌外,用多肿瘤标志物蛋白质芯片检测泌尿系和男性生殖系肿瘤可提高诊断的灵敏度,优于单项肿瘤标志物;诊断判别函数可明显提高泌尿系及男性生殖系肿瘤诊断的准确率,具有一定的临床参考价值。     

APE1 siRNA表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞APE1表达的抑制作用

目的构建DNA损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE1 siRNA表达载体pSilence APE1,观察其对骨肉瘤细胞HOS和9901APE1蛋白表达的抑制作用.方法设计合成APE1 siRNA cDNA序列与线性化pSilence 2.0-U6质粒连接后构建APE1 siRNA表达载体pSilence APE1,经酶切鉴定和测序确认.应用免疫组化检测骨肉瘤细胞APE1蛋白的表达,同时应用免疫印迹检测其对APE1基因的敲低作用的量效和时效关系.结果通过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了APE1 siRNA表达载体.免疫组化和免疫印迹证实pSilence APE1对骨肉瘤细胞APE1基因具有特异性"敲低"作用,其抑制APE1基因表达效率为72%～95%,而且其抑制作用以3.0μg pSilence APE1转染第3天最为显著.结论成功构建了APE1 siRNA表达载体pSilence APE1,并且该载体能有效地敲低骨肉瘤细胞APE1基因表达.     

EGFR抑制剂吉非替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂吉非替尼对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响,为原发性肝癌的分子靶向治疗提供实验依据.方法应用免疫组化法检测SMMC-7721细胞中EGFR的表达,不同浓度吉非替尼处理SMMC-7721细胞48 h后,MTT法检测细胞对该药物敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡变化.结果SMMC-7721细胞中EGFR呈强阳性表达,吉非替尼明显下调EGFR表达,抑制SMMC-7721细胞生长,呈剂量时间依赖性,8 mmol/L吉非替尼组细胞凋亡率为(58.58±2.95)%,显著高于对照组(0.11±0.04)%,(P＜0.01).结论吉非替尼能够通过诱导细胞凋亡抑制SMMC-7721细胞生长,因而有望为肝癌的分子靶向治疗提供新的有效途径.     

APE1和VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)与血管内皮生长因子(VEGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系。方法免疫组化法检测136例NSCLC组织APE1、VEGF的表达,并测定微血管密度(MVD),分析APE1、VEGF与MVD之间及三者与无病生存时间(DFS)的关系。结果 NSCLC组织中APE1、VEGF高表达率分别为77.94%和66.18%。APE1表达与性别、年龄、病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移无关,VEGF表达和MVD值与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。APE1与VEGF、APE1与MVD和VEGF与MVD分别呈正相关(r=0.369,P=0.000;r=0.256,P=0.003;r=0.387,P=0.000)。肿瘤大小、淋巴结转移及APE1和VEGF表达、MVD与DFS密切相关(P<0.05)。COX模型多因素分析显示,肿瘤大小、淋巴结转移和VEGF表达状态是影响NSCLC患者无病生存的独立危险因素。结论 APE1、VEGF的过表达与NSCLC肿瘤血管生成有密切关系,影响NSCLC患者局部复发和远处转移等无病生存预后。     

非小细胞肺癌血浆EGFR突变与肿瘤标志物水平的关系

目的 探讨非小细胞肺癌外周血游离DNA样本EGFR突变率与临床基线特征和血清肿瘤标志物表达水平的关系.方法 收集本院确诊为非小细胞肺癌166例.利用PCR和变性高效液相色谱法分析EGFR19和21外显子突变.其中89例同时利用多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统检测癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原153(CA153)等血清肿瘤标志物,分析突变率与临床基线特征和肿瘤标志物表达水平的关系.结果 166例非小细胞肺癌中,EGFR总突变率19.9％.女性突变率显著高于男性(P =0.037).腺癌突变率高于其他组织学类型,但未达到显著水平(P =0.096).CEA、CA153中高表达患者EGFR突变率显著高于低表达者(P =0.048,P=0.017),CA199高表达患者仅有高于中低表达者的趋势(P =0.093).多变量Logistic分析表明,组织学类型为腺癌,CA153、CEA中、高表达与EGFR突变率相关.结论 对于晚期非小细胞肺癌,血浆EGFR突变率与血清肿瘤标志物表达水平明显相关.其标志物水平可作为进一步判断EGFR突变优势群体的因素.     

多肿瘤标志物蛋白芯片检测中f-PSA及PSA在恶性肿瘤中的诊断价值

目的:探讨多肿瘤标志物蛋白芯片中游离前列腺特异性抗原(f-PSA)及前列腺特异性抗原(PSA)在各组人群中的表达及与其它指标的伴随情况及其临床意义。方法:收集我院可供分析的25076例多肿瘤蛋白芯片检测结果,分析f-PSA、PSA在各种人群、各种肿瘤患者升高情况,以及f-PSA、PSA升高伴随其他检测指标升高和在肿瘤中的分布。结果:f-PSA、PSA在恶性肿瘤患者中明显升高,且前列腺癌最高(56.02%),其次为大肠癌(6.03%);f-PSA、PSA伴随升高指标以CEA最为常见,其次为CA125、CA199、CA242,f-PSA;PSA/CEA伴随最常见于肺癌(44.77%),其次为胃癌(43.75%),f-PSA、PSA/CA125伴随最常见于胰腺癌(66.67%)和肝癌(45.95%)。结论:f-PSA、PSA单项升高对前列腺癌的诊断具有较高价值,f-PSA,PSA伴随或联合CEA、CA125升高更常见于肺癌及胰腺癌。     

核因子-κB在中耳胆脂瘤中的表达

目的 观察核因子-κB(NF-κB)在中耳胆脂瘤中的表达,探讨其在胆脂瘤上皮细胞高度增殖过程中的作用.方法 应用免疫组化法检测26例胆脂瘤上皮、20例正常外耳道皮肤中NF-κB及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况.结果 胆脂瘤上皮细胞均出现明显的NF-κB核转位,NF-κB及PCNA的表达显著高于正常外耳道皮肤组织,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 中耳胆脂瘤上皮具有高度增殖能力,NF-κB在胆脂瘤组织中的激活可能是中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖的一个原因.     

APE1RNA干扰提高骨肉瘤中子放疗敏感性的研究

目的应用pSilence APE1“敲低”HOS细胞APE1的表达，观察pSilence APE1联合中子放疗对HOS细胞生长抑制的协同作用并探讨其机制。方法用脂质体将pSilence APEI质粒导人HOS细胞，“敲低”HOS细胞中APE1的表达，同时给予^252Cf中子射线照射，MTT法绘出细胞存活曲线，克隆形成分析测算D37值和剂量修饰系数（DMF），彗星分析法检测照射后细胞的DNA损伤情况，并用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果由克隆形成分析得到对照质粒与转染pSilence APE1质粒的HOS细胞经^257Cf中子照射后的D37值为3．02和2．42，DMF值为1．43。以上2组HOS细胞以200、500和1000cGy3个剂量^252Cf子射线照射后，碱性彗星尾力矩分别是6．146±0．741、19．918±1．574、31．885±1．192和7．997±0．542、25．238±1．185、39．191±1．052（P〈0．01）；细胞凋亡率是4．00、5．91、9．63和5．68、7．55、13．51（P〈0．05）。结论pSilence APE1能显著提高HOS细胞对中子射线的敏感性，促进DNA损伤和细胞凋亡。pSilence APE1基因联合中子放疗可能成为今后骨肉瘤治疗的新方法。