人内质网分子伴侣BiP的克隆、表达及其在RA患者血清抗体检测中的作用

以类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜组织文库cDNA为模板,用PCR方法扩增得到1965 bp人内质网分子伴侣BiP的全长cDNA,将其克隆入OmicsLinkTM表达载体pReceiver-B01a,构建重组表达质粒pReceiver-B01a-BiP。重组表达质粒导入大肠杆菌BL-21(DE3)菌株中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTA agarose层析柱纯化。SDS-PAGE和免疫印迹法(Western blot)分析发现,表达产物以可溶性蛋白和包涵体形式共同存在,表达量约占菌体蛋白总量的20%~30%。相对分子质量约为80000,纯度达到电泳级。经免疫印迹法鉴定,获得的BiP重组蛋白可以与RA患者血清反应,检测的抗BiP抗体在RA患者血清中的阳性率为75.4%(49/65),明显高于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythe-matosus,SLE)患者14.6%(7/48)、原发性干燥综合征(primary Sj gren’s syndrome,pSS)患者7.3%(4/55)及正常人0%(0/71)(P<0.01)。表明,经原核表达获得的BiP全长蛋白,RA患者血清抗体可以很好结合,有望应用于临床血清学诊断。     

帕金森病大鼠模型额叶皮质的代谢及形态改变

目的：探讨帕金森病中大脑额叶皮质的形态及代谢改变。方法：大鼠实验组于6-OHDA毁损后用BIOSPEC47／30磁共振波谱仪(4．7T)，采用点分辨波谱法对双侧额叶皮质行H-MRS检测，分析该区N-乙酰天门冬氨酸／肌酸(NAA／Cr)和胆碱／肌酸(Cho／Cr)比值的变化，并用电镜观察该区神经元及突触的形态变化。结果：实验组大鼠损毁侧额叶皮质．NA．A／Cr比值显著低于对侧，对照组两侧无显著差别；Cho／Cr比值在两组的两侧相比均无显著差别。电镜观察显示：损毁侧额叶皮质的突触数量较对侧减少，突触前、后膜和突触小泡结构异常，典型突触结构消失，树突棘出现大片低电子密度区，细胞器消失。结论：帕金森病大鼠模型损毁侧额叶皮质内存在神经元缺失或突触数量的减少，突触结构异常及功能异常。     

凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌化疗抵抗中的作用

目的探讨x-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）和促凋亡因子Smac在胰腺癌细胞化疗抵抗中的作用，以及转染胞浆表达型Smac基因靶向下凋XIAP对化疗药物诱导的胰腺癌细胞凋亡的影响。方法应用流式细胞术检测顺铂、5-FU介导的Panc-1、BXPC-3的凋亡率及胞浆染色分析细胞XIAP表达变化，Western blot分析XIAP、Smac、Caspase-3表达水平；构建pEGFP-NI／Smac真核表达载体并转染胰腺癌Panc-1细胞，流式细胞术检测转染Smac基因前后Panc-1细胞的凋亡敏感性。结果与BXPC-3细胞相比，Panc-1对顺铂或5-FU介导的凋亡具有较强抵抗性，Western blot分析显示Panc-1细胞高表达XIAP，在化疗药物作用下化疗敏感细胞BXPC-3胞浆内XIAP水平下降明显多于Panc-1细胞，而且凋亡的BXPC-3细胞释放入胞浆内的成熟Smac蛋白水平明显高于Panc-1细胞。转染胞浆表达型Smac基因至化疗抵抗Panc-1细胞，可明显下调其XIAP表达水平，促进效应Caspase-3分子活化，显著提高顺铂、5-FU诱导的细胞凋亡率。结论胰腺癌细胞XIAP的表达水平下调与其化疗敏感性有关，XIAP是克服化疗抵抗的重要靶分子，而上调Smac活性蛋白的胞浆表达作为一种有效调节信号，通过拮抗XIAP的凋亡抑制作用协同化疗药物促进胰腺癌细胞凋亡。     

猪丘脑、小脑和延髓内Leptin长形受体mRNA的分布定位

目的 :研究猪丘脑、小脑和延髓内leptin长形受体 (longformleptinreceptor,Ob Rb)mRNA的分布定位 ,比较长白猪和眉山猪上述脑区内Ob RbmRNA分布的差异。方法 :原位杂交法。结果 :在丘脑内 ,Ob RbmRNA标记神经元几乎见于所有核团 ,在中线核、丘脑室旁核和丘脑前核内出现大量的Ob RbmRNA标记神经元 ,其余核团内Ob RbmRNA标记神经元分布较少。在小脑皮质三层中均有Ob RbmRNA标记神经元 ,以梨状神经元层和颗粒层分布较密集。在延髓下橄榄核、孤束核、迷走神经背核和舌下神经核有Ob RbmRNA标记神经元出现。结论 :猪丘脑、小脑和延髓内均有Ob RbmRNA分布 ,其分布定位在长白猪与眉山猪未见明显的差异。     

IFN-α诱导HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G的表达

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α(0 U/ml、100U/ml、400U/ml、800U/ml and 1200U/ml)刺激,10h后提取细胞总RNA,RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBEC3G的mRNA水平变化,Western blot分析APOBEC3G蛋白水平的表达;分别构建不同长度的含有IRF-E(IFN regulatory factor element)位点的APOBEC3G起始密码上游序列报告质粒、不含IRF-E和IRF-E位点突变的虫荧光素酶报告质粒,报告基因分析IFN-α刺激后APOBEC3G起始密码上游IPF-E位点对APOBEC3G表达的影响。结果IFN-α上调HuH7细胞APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,并具有剂量依赖的效应。序列分析发现APOBEC3G起始密码上游的-298～-283和-57～-47位碱基分别存在IRF-E和ISRE(IFN stimulated re- sponse element)序列。报告基因分析结果显示,干扰素使含有IRF-E序列的APOBEC3G启动子报告质粒的虫荧光素酶的活性增加6～8倍,而不含IRF-E序列和IRF-E位点突变的报告质粒的虫荧光素酶活性在干扰素刺激后几乎没有变化。结论IFN-α可通过IRF-E位点上调APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,从而发挥抗病毒效应。     

Induction of APOBEC3G in human hepatoma cells by interferon-α stimulation

To clarify the role of APOBEC3G (A3G) in cellular defense against hepatitis B virus ( HBV), the expression of A3G in normal human liver and the regulation of the A3G expression in hep-atoma cell line (HuH-7) were investigated. Expression level of APOBEC3s mRNA in human liver was determined by RT-PCR. HuH-7 and HepG2 cells were treated with various concentrations of IFN-α(0 U/ml, 100 U/ml, 500 U/ml, 1000 U/ml)for 12 h. The mRNA levels were measured by a quantitative RT-PCR, the results were normalized relative to the specimens without IFN-αstimulation. Total protein of HuH-7 cells treated with various concentrations of IFN-αfor 48 h was subjected to Western blot analysis. For reporter gene assay, HuH-7 cells were transfected with the reporter plasmids containing IRF-E sites and its mutants with different lengths. Then the cells were treated with or without 1200 U/ml IFN-a for additional 12 h (1000 U/ml) after 24 h of transfection, and the cell lysate was prepared and assayed for luciferase activity. It was found that normal human liver expressed the mRNA of A3G. A3G mRNA expression in HuH-7 and HepG2 cells were up-regulated by IFN-αstimulation in a dose-depen-dent manner. Western blot analysis indicated that A3G protein expression was also enhanced by IFN-αstimulation. Sequence analysis showed the existence of putative sites of IFN regulatory factor element (IRF-E) in 5' region of A3G gene upstream the initiation codon. IFN-αstimulation results in 6- to 8-fold increase in luciferase activity in cells transfected with the plasmid containing IRF-E sites of the 5' upstream sequences, whereas luciferase activity did not change in cells transfected with the plasmid containing mutant IRF-E sites or without IRF-E sites. As a conclusion, A3G are expressed in normal human liver. A3G expression was up-regulated by IFN-αstimulation in hepatoma cells and could be involved in host defense mechanisms against HBV. ERF-E site in 5' region of AP0BEC3G gene upstream the initiation codon plays an important role in this process.     

女性经前期复发性阿弗他溃疡患者血清IL-6、IL-8、TNF-α和sICAM-1的含量变化及其意义

目的:研究女性经前期复发性阿弗他溃疡(经前期RAU)患者血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)的变化状况, 并探讨经前期RAU的发病机制。方法:用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测女性经前期RAU患者外周血中IL-6、IL-8、TNF-α、sICAM-1的水平, 与正常对照组和无经前发作规律的女性RAU对照组相比。结果:经前期RAU患者的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平不仅显著高于正常对照组(P＜0.01), 而且高于女性RAU对照组(P＜0.01)。而sICAM-1无明显变化。女性RAU患者血清中TNF-α亦高于正常对照组(P＜0.05)。结论:经前期RAU患者体内存在IL-6、IL-8、TNF-α介导的免疫功能异常, 可能对RAU局部损害起作用。     

复合rhBMP-2的注射型成骨材料修复犬桡骨骨缺损的实验研究

探讨以纤维蛋白胶(fibrin sealant,FS)为载体,复合rhBMP-2\bFGF的注射型骨修复材料,修复犬桡骨节段性缺损的作用,为其临床应用提供实验依据.实验分为:实验组(FS bFGF rhBMP-2)、对照组(FS).于12只成年健康家犬右侧桡骨中上段造成2cm缺损,制成犬桡骨2cm骨缺损实验模型,然后严密缝合皮下组织及皮肤,将实验材料经伤口周围正常皮肤注射到骨缺损处,术后4、8、16、24w进行放射学检查,术后24w,标本进行组织学和骨密度检查,研究其成骨效应.结果表明:实验组骨缺损区在成骨活跃程度、骨密度和再生髓腔结构等方面均显著优于对照组,使骨缺损得到了成功的修复(P＜0.01).以纤维蛋白胶为载体复合rhBMP-2和bFGF的注射型骨修复材料,具有高效的骨修复能力,对犬的骨缺损有很好的修复效果.     

中性粒细胞对洗涤血小板聚集功能的影响

目的:观察非激活或激活的中性粒细胞(PMN)对洗涤血小板聚集功能的影响。方法:采用Born方法测定血小板聚集功能。结果:非激活的PMN(5×10⁹cells/L)上清液对ADP和花生四烯酸(AA)诱导的血小板聚集具有显著抑制作用,阿司匹林可增强这种抑制作用;肉豆寇佛波醇(fMLP)及血小板活化因子(PAF)激活的PMN悬液或其上清液均能活化血小板聚集,且PMN悬液的诱聚作用比其上清液更强;阿司匹林对fMLP或PAF激活的PMN悬液或其上清液均无明显抑制作用。结论:不同状态(非激活或激活状态)的PMN对正常血小板的反应性表现出完全相反的作用,即非激活的PMN抑制血小板反应性,而激活的PMN则具有促血小板活化聚集作用。     

冠心病家族史青少年载脂蛋白E、B的基因多态性

目的 探讨青少年载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)、apoB基因多态性对冠心病的遗传易感性。方法 应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性技术，对244名健康汉族大学生(冠心病家族史阳性者109人，阴性者135人)的apoE、apoB XbaI、apoB 3’可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat ，VNTR)基因型进行分析。结果 阳性组的e4、x^ 、VNTR—B(hypervariable element，HVE＞38)等位基因频率显著高于阴性组(P＜0．05)，且与血总胆固醇、低密度脂蛋白—胆固醇、aPoBl00水平升高有显著相关(P＜0．05)。结论 apoE的e4、apoB Xba I的x^ 、apoB3’VNTR的VNTR—B可能为冠心病的重要遗传标记。