从肝纤维化大鼠肝组织蛋白质组变化探讨肝与他脏关系的蛋白质基础

目的:以CCl_4大鼠肝纤维化为模型,研究肝与他脏在生理、病理之间的相互联系,为中医理论对“以象测脏”认识脏象的方法论提供科学依据,探讨中医整体观念的物质基础。方法:将 Wistar大鼠,随机分正常组、模型组。模型大鼠皮下注谢40％CCl_4-橄榄油溶液每周2次,共2周; 停止剌激后再观察4周,正常组以生理盐水替代CCl_4皮下注射。分别于第4、8、12、16周末分批处死大鼠。留取肝组织分别做病理、羟脯氨酸、蛋白质的分步提取。蛋白质定量后进行二维电泳,凝胶银染,运用PDQUEST 2-DE图象分析软件对获得的蛋白质图谱进行分析,运用MALDI-TOF-MS 鉴定了30多个差异表达的蛋白质。结果:①CCl_4肝纤维化大鼠出现生命活动整体反应,如体重、活动度等下降;②肝纤维化过程中存在蛋白质合成和物质代谢碍障;③蛋白质组改变的质谱鉴定。结果显示:肝纤维化大鼠与正常大鼠肝组织差异表达的蛋白质与物质代谢相关的蛋白质有过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移酶、磷酸甘油酸激酶;与神经内分泌相关的蛋白质分子有儿茶酚-邻 -甲基转移酶、雌激素转磺酶亚型6、转录起始因子、非粘附性细胞蛋白质。结论:肝与他脏功能相关、病理相连是以蛋白质分子为物质基础,肝纤维化是一个涉及多个功能的整体病变过程,而引起机体整体功能改变的物质基础是蛋白质分子。     

工欲善其事必先利其器--浅谈大科学时代中医药现代化研究面临的机遇和挑战

大科学时代为中医药现代化研究提供了绝好的机遇和挑战,我们必须重新认识以往中医基础理论研究的思维方式,克服"以西解中"的致命弱点;必须大胆地去"证伪";还必须重视大科学时代中医药人才培养模式,为中医药现代化研究提供充足的人力资源保证.     

基于代谢组学方法的湿热证“异病同证”研究

目的：从代谢组学变化层面揭示“湿热证”异病同证的物质基础。方法：以慢性乙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及慢性肾小球肾炎的典型湿热证患者各30例为研究对象,以健康者30例为对照,联合选用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪和气相色谱-飞行时间质谱仪两个代谢物检测平台,对血清样本进行全谱代谢组学检测。并运用多维统计方法对数据进行分析,以探索三种不同疾病湿热证的共性及特异性变化物质。结果：通过比较不同疾病湿热证组间代谢组学差异物质,并与健康组对照,发现肌苷、尿苷、天门冬氨酸、油酸甘油酯、乳酸盐是三种疾病湿热证的共同变化物质。结论：基于代谢组学技术发现,上述三种不同疾病的典型湿热证之间,既有反映不同疾病的差异性物质,又存在与湿热证相关的共性物质,从而在代谢水平上为中医“异病同证”理论提供了客观依据。     

中西医结合抗肝纤维化的研究思路与方法

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经病理过程，现代医学与中医学在该领域各有优势，如何发挥两种医学的思维优势，开展中西医结合抗肝纤维化研究是目前所面临的关键科学问题，本文从病证结合、方证相应，以及以效应评价为基点，解析不同功效中医古典方剂防治肝纤维化机制的新进展，彰显在中医学思维指导下，充分应用现代科学技术手段，探究难治性疾病的治疗方法，以期为中西医结合抗肝纤维化研究提供思路与方法。     

GDC-0449在CCl4联合二乙酰氨基芴诱导肝纤维化大鼠模型中的作用

目的 研究Hedgehog信号通路抑制剂维莫德吉（GDC-0449）对CCl₄联合二乙酰氨基芴（2-AAF）诱导的大鼠肝纤维化的干预作用。方法 将18只Fisher344雌性大鼠随机分为正常组、CCl₄联合2-AAF模型组（CCl₄/2-AAF组）和GDC-0449组,每组6只。CCl₄/2-AAF组和GDC-0449组大鼠按2 mL/kg体质量皮下注射30%CCl₄-橄榄油溶液,每周2次,持续造模6周;自第7周始,在注射CCl₄-橄榄油溶液同时予2-AAF(100 mg·kg^-1·d^-1)灌胃,同时GDC-0449组大鼠按25 mg·kg^-1·d^-1灌胃干预,正常组大鼠予等体积橄榄油溶液注射及生理盐水灌胃,9周末处死取材。HE染色和天狼猩红（SR）染色观察各组大鼠肝组织病理及胶原沉积变化,SR阳性染色面积半定量分析和Ishak评分评估纤维化程度;碱水解法测定肝组织羟脯...     

大鼠胆汁淤积性肝硬化的动态病理变化及其意义

目的：观察胆汁淤积性大鼠肝硬化形成过程中模型动态变化特点。方法：结扎大鼠胆总管制备大鼠胆汁淤积性肝硬化模型；结扎后3天、1周、2周、3用、4周、5周后杀鼠取材，观测大鼠一般状况，肝功能、肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量测定，肝组织病理学及CK-19免疫组织化学观察。结果：与假手术组大鼠比较。模型组大鼠肝重、脾重、肝／体比、脾／体比均呈先增加后降低的动态变化；血清Alb含量持续下降，而TP含量呈先高后低的变化；血清ALT活性在结扎3天后最高，2周时最低；GGT活性及TBil含量自造模后呈持续增高；而ALP活性在2周时最高；肝组织Hyp含量从结扎后呈持续增加；结扎3天后汇管区已见胆管增生，至3周时增生逐渐加重。CK-19免疫组织化学染色观察，胆管上皮细胞第3天起开始增生，1周、2周时增生明显，3周后增生渐减。4周、5周时肝组织呈花环样改变，肝实质细胞显著减少。可见肝细胞去分化现象。结论：①胆汁淤积性大鼠肝硬化模型主要病理改变有胆汁淤积、胆管上皮细胞增生、肝细胞减少、胶原增生和沉积与新生的胆管上皮细胞关系密切。②血清ALT水平由高到低，5周末仅比假手术组稍高。AST活性一直维持在较高水平。③肝细胞的减少方式除了凋亡、坏死外，可见去分化现象。     

细胞增殖与凋亡相关蛋白质在大鼠肝纤维化形成与消减中的动态变化

目的通过对四氯化碳诱导纤维化大鼠肝组织蛋白质组的分析，研究与增殖、凋亡相关蛋白质在肝纤维化过程中的动态变化，探讨细胞增殖与凋亡在肝纤维化形成及发展中的作用。方法将Wistao大鼠随机分为正常组、模型组。模型组大鼠皮下注射40％四氯化碳一橄榄油溶液，每周2次，共l2周，停止刺激后再观察4周。分别于第4、8、12、l6周末分批取材。留取肝组织分别做病理组织学、羟脯氨酸检查与蛋白质的分步提取。蛋白质定量后进行二维电泳，凝胶银染，用PDQUEST 2-DE图像分析软件对获得的蛋白质图谱进行分析，运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）鉴定30多个差异表达的蛋白质。结果从第1周开始模型组大鼠肝组织的胶原沉积、羟脯氨酸持续增高，在12周最高（P〈0．05），l6周下降（P〈0．05），各时间点模型组与正常组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；模型组大鼠肝组织蛋白质组较正常组也有较大改变。经MALDI-TOF-MS鉴定与细胞增生相关的蛋白质或酶为：细胞增殖核抗原p120与p40、细胞周期蛋白F和泛素结合酶UBC7；与细胞凋亡相关的蛋白质主要有胱门蛋白酶12，只在模型组大鼠肝组织表达。结论与细胞增生、凋亡的相关蛋白质表达量在肝纤维化发生发展的不同阶段呈动态变化；在肝纤维化形成过程中细胞增生与凋亡受到相关蛋白质的调节。     

蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导大鼠脂肪性肝纤维化肝细胞再生障碍的机制

目的 获取通过改变饮食习惯可逆转脂肪性肝纤维化的证据;明确非酒精性脂肪性肝纤维化肝细胞增殖障碍的发生机制.方法 (1)蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCDD)喂养10周诱导非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠模型,恢复组于第9周开始将MCDD转变为蛋氨酸-胆碱对照饮食(MCCD)喂养2周.(2)纤维化和炎症程度采用肝组织病理染色方法评价,肝星状细胞、Kupffer细胞活化采用免疫组化、蛋白质印迹或实时PCR方法评价.(3)肝细胞凋亡和增殖分别采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色法和BrdU染色法评价,肝细胞再生相关细胞因子白细胞介素(IL)-6、抗信号转导与转录激活因子3(STAT3)、多克隆抗体抗c-Jun N端激酶1(JNK-1)、c-Jun、多克隆抗体抗CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、p21、多克隆抗体抗肝细胞核因子6(HNF6)、肝细胞生长因子(HGF)-α表达分别采用实时PCR及蛋白质印迹方法评价.结果 (1)MCDD转变为MCCD后组织病理学显示肝细胞脂肪沉积及炎症反应明显减轻.(2)伴随着活化的肝星状细胞和Kupffer细胞减少,肝纤维化程度明显减轻.(3)模型组肝细胞凋亡数量显著高于正常组和恢复组(68±16比40±8、48±6,均P<0.05);肝细胞增殖/凋亡比值显著低于正常组和恢复组(0.10±0.03比0.19±0.03、0.41±0.09,均P<0.01);恢复组增殖数量显著高于模型组(17.2±4.4比7.5±3.0,P<0.01).(4)模型组IL-6、JNK-1、c-Jun、C/EBPα、p21、HNF6 mRNA表达均显著低于正常组(0.34±0.18、0.41±0.11、0.19±0.03、1.94±0.64、0.34±0.20、0.47±0.21比1.33±0.44、0.83±0.26、1.53±1.20、4.51±1.15、1.30±0.75、0.92±0.16,P<0.05或P<0.01);且模型组上述指标及STAT3蛋白表达亦明显低于正常组(P<0.05或P<0.01);恢复组仅IL-6、JNK-1和p21 mRNA和蛋白表达显著高于模型组(P<0.05或P<0.01).结论 饮食结构调整对于脂肪性肝纤维化的组织学改善具有重要的治疗意义;MCDD脂肪性肝纤维化肝细胞再生抑制与G_0至S期进入障碍有关,促进IL-6、JNK-1和p21的表达可能对于脂肪性肝纤维化恢复具有重要的治疗意义.     

基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS技术分析黄芪汤颗粒的化学成分与小鼠口服后的入血成分

目的 运用超高效液相串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS)技术，分析鉴定黄芪汤颗粒的化学成分及小鼠灌胃黄芪汤颗粒后的主要入血成分。方法 色谱分离采用Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱。质谱采用电喷雾电离正离子模式(ESI⁺)和电喷雾电离负离子模式(ESI-)交替扫描，并自动触发二级质谱扫描功能(Full MS/dd-MS2)采集质谱数据。经Xcalibur 3.0软件获取色谱保留时间以及母离子和碎片离子信息，定性鉴别黄芪汤颗粒的化学成分及小鼠灌胃黄芪汤颗粒后的入血成分及可能的代谢途径。结果 综合保留时间、准确分子量、二级碎片信息、对照品比对、文献参考等色谱质谱检测信息，从黄芪汤颗粒中共鉴定出167种化学成分，从小鼠灌胃黄芪汤颗粒后的血清中共检测到甘草素、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷等60种原型成分和43种代谢产物。结论 完成了黄芪汤颗粒化学成分及主要入血成分快速鉴定，可为黄芪汤颗粒效应...     

肠道菌群在自发性细菌性腹膜炎发生发展中的作用

自发性细菌性腹膜炎(SBP)是肝硬化的主要并发症之一。近年来,随着高通量测序技术及肠道宏基因组学研究等生物技术的发展,肠道菌群在肝脏疾病中的作用越来越受到关注,细菌易位特别是来自肠道革兰阴性肠杆菌的易位参与了SBP的发生发展。简述了SBP发生发展的各种相关因素及肠道菌群在SBP中发挥的重要作用。生物技术的提高使肠道菌群在疾病中的作用日渐清晰,恢复肠道菌群平衡有望成为防治SBP的新思路。