筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐(MTT)比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。     

睡眠中仰卧位小重量后伸牵引治疗颈椎病（附90例报告）

睡眠中仰卧位小重量后伸牵引治疗颈椎病（附９０例报告）邵亚平，刘巨超，张福贵，张彦来颈椎病是中老年人的常见病。我院自１９８８年７月～１９９４年７月采用睡眠中的仰卧位小重量后伸牵引治疗，收到满意效果。现将随访的９０例总结报告如下：１临床资料１．１一般资料...     

综合治疗跟痛症观察

目的：观察局部封闭加麝香跟痛散填充足跟垫治疗跟痛症的疗效。方法：局部封闭组、局部封闭加麝香跟痛散填充足跟垫治疗组随机治疗各40例。结果：有效率综合治疗组92.5%,局部封闭组70%。结论：局部封闭加麝香跟痛散填充足跟垫治疗跟痛症优于局部封闭。     

新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源.目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08 在解放军总医院普通外科研究所完成.材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄.方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养.采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析.主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度.结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×10~6～2×10~6/肝,活力在90%以上, 光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小.通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上.肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态.培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15 d时可见少量阳性细胞.培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降.结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法.     

三法一练协同治疗腰椎间盘突出症临床观察

目的:观察三法一练协同治疗加口服药物治疗腰椎间盘突出症的疗效。方法口服药物组、三法一练协同治疗加口服药物组随机治疗各50例。结果:综合治疗组总有效率96％,口服药物组总有效率80％,临床治愈率综合治疗组与口服药物组分别为80％、50％。结论:三法一练协同治疗加口服药物治疗腰椎间盘突出症优于单纯口服药物。     

骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及肝内移植研究

目的 观察体外诱导骨髓问充质干细胞分化及肝纤维化形成环境中移植情况。方法 首先行骨髓间充质干细胞提取、分离和培养，加入肝细胞生长因子（HGF，20μg／L）和表皮生长因子（EGF，1．5mg／L）诱导定向分化。肝纤维化形成的大鼠随机分成2组，每组10只。使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记诱导的骨髓间充质干细胞，经门静脉向肝纤维化形成的SD大鼠肝脏移植，对照组用BrdU标记未经诱导的骨髓间充质干细胞。2周后通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏标记细胞的分布及BrdU^＋／ALB^＋细胞数量。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化的细胞CK8及ALB表达阳性。移植2周后大鼠肝脏均可检测到BrdU标记细胞，与对照组相比诱导后骨髓问充质干细胞组BrdU^＋／ALB^＋细胞数较多，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 经体外诱导骨髓间充质干细胞能分化为肝细胞，移植在大鼠肝纤维化形成环境中，白蛋白表达细胞数更多。     

肝大部切除术后小鼠血浆蛋白质组双向凝胶电泳图谱差异分析

目的利用蛋白质组学的研究方法建立分辨率高和重复性好的肝大部切除术后小鼠血浆的双向凝胶电泳图谱，描述肝大部切除后早期血浆蛋白质组变化的概况。方法以肝大部切除术方法制备小鼠模型，对12h后切肝组及对照组小鼠血浆样品分别进行双向凝胶电泳，每组设平行胶3块，凝胶经银染显色后，Imaging Master 2D图像分析软件进行比较分析，识别差异表达的蛋白质。结果与对照组比较。切肝后12h小鼠血浆蛋白中新增蛋白点37个，缺失15个，浓度上调蛋白点4个，下调7个，总的差异表达蛋白点数为63个。结论本研究建立了分辨率高且重复性较好的肝再生小鼠的血浆蛋白质组学双向凝胶电泳图谱，发现了一批与对照组相比差异表达的蛋白质。为进一步分析鉴定与肝脏再生启动相关的关键蛋白，探寻肝脏再生的机制莫定了基础。     

用新生大鼠肝细胞体外构建工程化肝组织*

目的: 在供体肝短缺的情况下，构建可植入的工程化肝组织具有重要的临床意义。实验尝试以新生大鼠肝细胞为种子细胞体外构建工程化肝组织，以期进一步的体内植入。 方法：实验于2007-04/08在解放军总医院普通外科研究所完成。①实验材料：SPF级、出生24 h以内的雄性SD新生大鼠。②实验过程：采用胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞；以2×L-DMEM液（添加地塞米松10 μg/L、表皮生长因子20 μg/L、肝细胞生长因子40 μg/L及胰岛素0.04 U/mL）与液态鼠尾胶原等比例混合；再将肝细胞与胶原凝胶复合构建细胞/凝胶复合物，接种于培养板进行培养。③实验评估：培养后第1，3，5，7，9天，采用相差显微镜观察、四甲基偶氮唑盐比色法、苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色分别对工程化组织的生长情况及组织形态特征进行观察，并对工程化组织的白蛋白合成功能及尿素的代谢水平进行评价。 结果：①肝细胞与胶原凝胶复合后，细胞均匀的分布在复合物中。在整个培养过程中，肝细胞保持着稳定的细胞形态。②四甲基偶氮唑盐检测显示肝细胞活性在生长初期平缓下降，直至第5天时仍然保持75%的细胞活性，之后快速下降。③体外培养5 d后，相差显微镜下观察显示肝细胞在胶原凝胶中呈三维立体生长，并保持肝细胞胞体圆形，核大而圆的特异形态；免疫组织化学证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性。④对培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明胶原凝胶中的肝细胞在培养初期保持着稳定的代谢合成功能。 结论：用新生大鼠肝细胞及胶原构建出一种有功能的工程化肝组织模型，这种模型可以应用于今后的工程化肝组织研究。     

肝组织工程支架评价方法研究

目的：以人肝细胞系HepG2作为种子细胞,建立一种细胞支架评价方法,为肝组织工程筛选合适支架。方法：将HepG2细胞接种在生物可降解聚合物支架——聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）、壳聚糖（3％CS）和丝素（2％SF）上．体外常规培养;采用四唑盐（MTT）比色法、HE染色和尿素氮检测试剂盒对接种在支架上HepG2细胞的生长、分布及功能情况进行检测。结果：培养在3种支架上的HepG2细胞均维持增殖状态,相比之下．丝素支架上的细胞增殖较快,而PLGA和壳聚糖支架上的细胞增殖相对缓慢;培养至第7d时,组织学检测显示丝素支架上的HepG2细胞分布均匀,数量最多;而在PLGA和壳聚糖支架上只能发现少量细胞;细胞功能检测显示丝素和PLGA支架上的尿素合成能力下降缓慢,而壳聚糖支架上的尿素合成能力快速下降。结论：3种支架均具有比较好的生物相容性：相比较而言．丝素更适合作为肝组织工程支架;该方法可用于批量筛选肝组织工程支架。     

工程化肝组织肝表面片状植入新方法

目的 探索较大尺度工程化肝组织原位肝表面贴覆片状植入、尽快建立血供的可行性.方法 将采用胰酶冷消化法分离的新生大鼠肝细胞(1×1010个/L)、肺组织块贴壁法分离的大鼠微血管内皮细胞(1 ×1010个/L),与片状胶原支架、血管内皮生长因子(VEGF,10g/L)复合构建肝细胞/内皮细胞/血管生长因子/胶原支架复合的片状工程化肝组织.将其在15只大鼠肝表面贴覆植入,4周后取样进行大体观察及组织切片苏木素-伊红(HE)染色.结果 分离的肝细胞及内皮细胞活率均为90％以上.片状工程化肝组织经肝表面贴覆法植入后,大体观察可见能与原位肝脏紧密贴合生长,形成体积大于1 cm3的类肝样组织.体内植入后4周,植入物与肝脏贴合紧密,融合生长.组织学观察显示移植物中肝细胞均匀分布,未见细胞变性及死亡,有血管生成.结论 肝表面贴覆植入法简便安全,可构建较大尺寸的工程化肝组织,有望达到原位修复受损肝脏的目的.