我国生物技术研究趋向、进展与展望

一、生物技术的发展趋向 近10年来国际上生物技术的发展,有以下趋向和特征: 1.基因操作技术不断完善,特别是基因转移技术、基因扩增技术,基因克隆技术、蛋白质构象克隆、基因修饰技术等,并通过商业渠道出售专项技术全套试剂,大力推广。目前,基层临床医生已能     

携带外源基因的rAAV-2在人树突状细胞中的稳定表达

目的:观察2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体介导外源基因对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的感染效能。方法:采用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的rAAV-2进入DC的过程;用不同的感染复数(MOI)的rAAV-2-Luc和rAAV-2-GFP感染新分离的DC,荧光素酶(Luc)检测试剂盒检测Luc的表达和流式细胞术(FACS)检测GFP表达细胞的百分率。结果:加入rAAV-2后80分钟就可见病毒吸附在DC膜上,至90分钟可完全进入细胞内;MOI为1×104vp/cell时就可检测到Luc的表达,并呈现出随着MOI的加大而提高的趋势,自MOI为5×105vp/cell起,再提高MOI值并不能明显增加luc的表达;rAAV-2介导外源基因感染DC 48小时后就可检测到表达,从96~240小时表达水平无明显变化;GFP的表达率为5~18%。结论:rAAV-2介导外源基因能有效感染DC,感染的DC可稳定表达外源基因,rAAV-2载体体外遗传修饰的DC可以进一步用于ex vivo途径的免疫治疗研究。     

人新型干扰素K的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFN-κ)并初步研究其生物学活性.方法克隆hIFN-κ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFN-κ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFN-κ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性.结果成功地获得了高纯度的rhIFN-κ,纯度在90%以上.利用WISH-VSV系统检测rhIFN-κ的抗病毒活力为2.0×106 IU/mg.与rhIFN-α2b的比较发现,rhIFN-κ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者.结论rhIFN-κ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFN-κ的敏感性是不同的.     

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生

来源于维多利亚水母 (Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃ ｔｏｒｉａ)的绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)是近年来发现的一种新的报告基因 ,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点 ,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1 ] 。重组腺病毒伴随病毒 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ｒＡＡＶ)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点 ,是目前比较理想的基因治疗载体。构建表达ＧＦＰ的ｒＡＡＶ载体 (ｒＡＡＶ ＧＦＰ)对于…     

逆转录病毒载体介导人 GM-CSF 基因在 HL-60 白血病细胞的高效转移和表达

目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性，为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７，获得重组逆转录病毒，将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞，经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群，应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移并整合到ＨＬ－６０细胞基因组中，而未转基因和转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经ＰＣＲ检测未能扩增出特异性片段。经ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１检测，转基因细胞分泌的ＧＭ－ＣＳＦ生物学活性为６０～２００ｎｇ／ｍｌ（细胞１×１０６，培养２４小时），而未转基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞培养上清无ＧＭ－ＣＳＦ活性。结论逆转录病毒载体介导的ｈＧＭ－ＣＳＦ基因能在体外培养的人ＨＬ－６０白血病细胞中获得高效的转移和表达。     

黄芪某些生物学活性的有效部分的研究

本文就黄芪的有效成分进行了筛选研究。结果表明:多糖、蛋白等大分子酒精不溶部分具有促进抗体形成作用;氨基酸、生物碱部分具有抗病毒、促进抗体形成、延长细胞体外存活等活性;黄酮类部分具有抗冉毒、抗菌作用;甙类部分具有延长细胞体外存活,促进免疫反应,抗病毒等活性。     

福氏2a志贺菌磷酸烯醇丙酮酸盐合成酶基因的克隆与序列分析

目的：福氏2a志贺菌301株染色体编码与代谢相关的酶类基因，分析结构特点并进行同源性比较，以期部分阐明其与大肠杆菌生化特性相似的分子生物学基础。方法：鸟枪法随机克隆福氏2a志贺菌染色体DNA，经探针杂交和末端核苷酸序列测定筛选出带有磷酸烯醇丙酮酸合成酶（pps）完整基因的阳性克隆，利用exouclease Ⅲ制备嵌套缺失体亚克隆，采用双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：福氏2a志贺菌301株pps基因（全长2474bp）与大肠杆菌pps基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为98．8％和97．6％。编码区上游和下游存在较多变异。福氏2a志贺菌301株pps基因与GenBank中其它菌株pps基因的同源性均低于55％。结论：福氏2a志贺菌pps基因苷酸序列与大肠杆菌pps基因核酸序列高度同源。     

一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1

目的 构建一组具有AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1，从中选出功能较强者用于重组AAV的生产。方法 采用一套含有HSV-1基因组的粘粒系统构建重组HSV-1。首先将2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）rep基因的起始密码子ATG人工定点突变成ACG；然后将自身启动子控制下的AAV-2rep(起始密码子突变或未突变）和cap基因分别插入粘粒上HSV-1的UL2基因或UL44基因，构建成重组粘粒cos6-rmc/△UL2,cos56-rc/△UL44cos56-rmc/△UL44；将重组粘粒上的HSV-1片段分别与HSV-1的其余片段进行同源重组，得到3株重组HSV-1，连同过去报道的一株重组HSV-1一起，分别命名为HSV1-rc/△UL2,HSV1-rmc/△UL2,HSV1-rc/△UL44,HSV1-rmc/△UL44。结果 4株重组HSV-1经PCR鉴定均含有rep基因，分别感染携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的AAV载体细胞株后均能产生重组AAV，重组AAV可在BHK-21细胞中表达GFP，HSV1-rc/△UL2和HSV1-rmc/△UL2对AAV载体的包装能力明显强于HSV1-rc/△UL44和HSV1-rmc/△UL44。结论 构建的4株重组HSV-1均具有复制和包装重组AAV的能力，其中HSV1-rc/△UL2和HSV1-rmc/△UL2功能较强，有望用于重组AAV的大规模生产。