中国人Canstatin基因的克隆

目的Canstatin是新近发现的血管生成抑制剂,具有很强的抑制肿瘤血管生成的功能,本研究拟克隆和鉴定中国人的Canstatin基因,为进一步研究Canstatm基因的功能奠定基础.方法用RT-PCT法从中国人肝组织中获得Canstatin的cD-NA,克隆到pCMV-Script载体中测序,并在GenBank中进行同源性分析.结果成功克隆了Canstatin基因cDNA编码序列并获得测序证实.结论中国人Canstatin基因编码序列,经同源性分析与国外文献报道序列一致,初步证明该基因可能属于人类基因中序列保守的基因.     

人血管能抑素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生

目的:探讨人血管能抑素(canstatin)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移和血管新生的影响.方法:将pCMV-Script/canstatin及空载体pCMV-Script通过电穿孔的方法转染A549细胞,G418筛选获得阳性克隆.RT-PCR检测转染后细胞中canstatin mRNA的表达,Western blotting检测转染后细胞中canstatin蛋白的表达.建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,观察pCMV-Script/canstatin组A549细胞培养上清对小鼠Lewis肺癌移植瘤的治疗作用,免疫组化检测各治疗组荷瘤小鼠移植瘤的微血管密度.结果:pCMV-Script/canstatin转染A549细胞在G418筛选后成功形成克隆,转染的A549细胞能有效表达canstatin mRNA和蛋白.pCMV - Script/canstatin治疗组小鼠肿瘤体积明显小于pCMV-Script组和NS组[(1.47 ±0.21)cm3 vs(2.43 ±0.15) cm3、(2.53 ±0.18) cm3,P ＜0.01);pCMV-Script/canstatin组、pCMV - Script组和NS组的肺转移结节数分别为(3.00±1.00)、(7.80±1.48)、(7.60 ±2.41)个,pCMV-Script/canstatin组肿瘤转移受到显著的抑制(P＜0.01);pCMV-Script/canstatin组小鼠的肿瘤组织微血管数明显少于pCMV-Script组和NS组[(84.40 ±8.83) vs (188.68 ±11.15)、(190.24±12.91)个,P＜0.01].结论:pCMV-Script/canstatin能在A549细胞中表达并分泌至细胞外,canstatin可明显抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移和血管新生.     

应用染色体显微切割技术筛选人小细胞肺癌多药耐药相关基因的实验研究

目的应用染色体显微切割技术筛选人小细胞肺癌多药耐药基因。方法在倒置显微镜下,显微切割人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)多药耐药(multidrug-resistance,MDR)细胞系NCI-H446/CDDP特异性畸变染色体并构建该染色体片段DNA微文库,然后采用菌落斑点杂交、反Northern Blot及Northern Blot等方法,筛选人SCLC MDR相关基因。结果筛选出25个在耐药细胞中上调表达的基因或DNA片段。在已测序的20个DNA序列中,3个分别为人类2号和5号染色体BAC片段DNA序列,在全长库中未检索到其对应的相似序列,可能代表了某个基因或者该序列位于基因变异丰富的3’端,而无法查到与其它物种基因的同源性。其它17个序列与已知基因存在95%～100%的同源性。已知基因包括硫氧还蛋白、Bcl-2、TRAF、神经酰胺等基因。结论多个基因可能构成网络调控系统,参与人SCLC MDR相关基因的形成,但其具体的调控机制,则仍需大量的研究探索。     

868例危重患者碱中毒的分析

目的：探讨危重患者碱中毒类型、特点及原因。方法：分析了８６８例危重患者１４７０例次动脉血气、血电解质参数及临床资料。结果：危重患者碱中类型依次为呼吸性碱中毒（呼碱,６６８例次,４５．４４％）,代谢性碱中毒（代碱,３６２例次,２４．６３％）,呼碱并代碱（２７０例次,１８．３７％）,呼碱型三重酸碱失衡（１０２例次,６．９４％）,呼吸性酸中毒（呼酸）并代碱（６８例次为４．６３％）。其中７７３例次ＰａＯ２     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

诺氟沙星金属盐的合成及体外抑菌实验

目的:制备诺氟沙星金属盐类新化学单体及观察其体外抑菌活性。方法:以诺氟沙星及数种金属盐为原料进行化学合成,以固体培养基平板药敏试验方法对合成品作体外抑菌试验观察其活性。结果:完成诺氟沙星银、诺氟沙星锌、诺氟沙星铈、诺氟沙星钴、诺氟沙星铋5种金属盐的合成及其初步质量标准考察。结论:体外抑菌实验表明,诺氟沙星银、诺氟沙星锌、诺氟沙星铈、诺氟沙星钴、诺氟沙星铋对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌的抑制作用明显高于磺胺嘧啶银。     

肺癌患者IL－2RmRNA表达的临床意义

制备了人ＩＬ－２ＲａｃＤＮＡ探针，采用斑点印迹杂交法对４６例肺癌患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）ＩＬ－２ＲｍＲＮＡ的表达水平进行研究。结果发现ＩＬ－２ＲｍＲＮＡ的表达程度与肿瘤转移关系密切。肺癌无转移组：ＩＬ－２ＲｍＲＮＡ表达显著高于对照组与转移组（Ｐ＜０．００１），且与患者的组织学类型及病期有明显关系。转移组：ＩＬ－２Ｒ表达显著低于对照组（Ｐ＜０．００１），提示此组病人存在免疫抑制．其抑制可能存在细胞活化阶段或ＩＬ－２Ｒ的转录水平。同期所测血清肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在两组患者无明显差异。本组结果提示：ＩＬ－２ＲｍＲＮＡ表达水平与患者预后密切相关。     

肺损伤机制研究:脂多糖结合蛋白抑制肽对脂多糖诱导的人单核细胞株核转录因子κB活性的影响

目的:探讨肺损伤机制和脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-bindingprotein,LBP)抑制肽对脂多糖诱导的人单核细胞株U937细胞核转录因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)活性的影响,研究LBP抑制肽对脂多糖所致肺损伤的作用。方法:佛波脂诱导U937成熟后分为5组。即正常对照组;脂多糖组(10μg/L脂多糖+100μg/L重组人LBP);低剂量抑制肽组;中剂量抑制肽组;高剂量抑制肽组(后3组分别给予10,100和1000μg/L抑制肽)。用免疫细胞化学染色图像分析法和蛋白质定量分析法(Westernblot)测定U937细胞NFκB的活性;ELISA测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:脂多糖刺激后NFκBP65进入核内,抑制肽组核易位明显减少。低、中、高剂量抑制肽组P65核浆灰度比分别为0.59±0.06,1.02±0.12和1.08±0.10,明显低于脂多糖组1.34±0.12)(t=4.756,P(<0.01;t=2.235,2.308,P<0.05)。低、中、高剂量抑制肽组TNF-α水平分别为(93.66±2.30),(75.78±6.55)和(71.50±7.75)pg/L,明显低于脂多糖组犤(128.67±39.67)pg/L犦(t=2.216,P<0.05;t=2.423,2.389,P<0.01)。结论:LBP抑制肽抑制了U937细胞NFκB的活性和TNF-α的释放;LBP抑制肽对脂多糖所致肺损伤可能具有潜在的预防作用。     

bcl-2、bax在NHE-1核酶基因转染所致缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡中的作用

目的　探讨 bcl 2、bax表达在 Na / H 交换器 1(NHE 1)抑制而诱导缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)凋亡中的作用。方法　将转染 NHE 1特异性核酶基因大鼠的 PASMCs置于缺氧条件下(O2 的体积分数 <1% )培养 ,分别在缺氧 0、2、6、12、2 4和 4 8h采用原位细胞凋亡检测法观察细胞凋亡情况 ,荧光指示剂 Fura 2 / AM测定法检测细胞内 Ca2 浓度 (〔 Ca2 〕i)变化 ,半定量逆转录聚合酶链反应方法检测细胞内 bcl 2 m RNA和 bax m RNA表达变化 ,免疫组化法检测细胞内 Bcl 2蛋白和 Bax蛋白表达的变化。结果　转染 NHE 1特异性核酶基因大鼠的 PASMCs在缺氧培养时 ,其细胞凋亡率随缺氧时间的延长而逐渐升高 ,但是〔 Ca2 〕i升高的幅度较小 ,从缺氧 6 h起就显著低于同时间点的对照组和转染逆转录病毒真核表达载体空载体组 (P均 <0 .0 1) ,bcl 2 m RNA及蛋白表达显著降低 ,bax m RNA和蛋白表达显著增加(P均 <0 .0 1)。结论　 NHE 1抑制可能通过阻止 PASMCs的〔 Ca2 〕i增加 ,并引起 bcl 2表达降低及 bax表达增加而诱导和促进缺氧培养的 PASMCs凋亡     

Fas和FasL在Na+/H+交换器-1抑制诱导缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡中的作用

目的探讨Fas、FasL在Na^＋／H^＋交换器-1（NHE-1）抑制所诱导的缺氧大鼠肺动脉平滑叽细胞（PASMCs）凋亡中的作用。方法将转染NHE-1特异性核酶基因的大鼠PASMCs置于缺氧条件下（O2的体积分数低下1％）培养。缺氧培养2、6、12、24和48h后用原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡情况；半定量逆转录-聚合酶链反应（sqRT—PCR）疗法检测细胞内fas和fasL mRNA表达变化；免疫细胞化学法检测细胞内Fas和FasL蛋白表达变化。结果转染NHE-1特异性核酶基因的大鼠PASMCs在缺氧培养时，其细胞凋亡率随缺氧时间的延长而逐渐升高，但细胞内fas、fasL mRNA及Fas、FasL蛋白表达与对照组细胞比较差异均无显著性。结论Fas／FasL死亡通路可能不参与NHE-1抑制而诱导缺氧大鼠PASMCs凋亡的调控。