RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达

目的 构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用.方法 利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可凋控载体pRSl7.RUDsRed.在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达.结果 PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达.结论 成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的 基凶表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础.     

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肿瘤的基因治疗 (包括抑癌基因、自杀基因及免疫调节因子等 )在动物体内中取得了明显疗效。目前 ,全世界已有2 75项肿瘤的基因治疗方案进入临床研究 ,但整体疗效令人失望[1,2 ] 。临床研究表明 :肿瘤的基因治疗方案是非常安全的 ,但其抗肿瘤效应也非常低 ,甚至无任何治疗作用。尽管其原因是多方面的 ,但最主要原因是目前基因治疗载体系统在体内存在着转染率低、抗癌基因表达量低及不能靶向肿瘤细胞等缺点 ,从而不能将抗癌基因转染给足够多的肿瘤细胞 ,并使之高效表达 ,这严重阻碍着肿瘤基因治疗在临床中的疗效[1～ 3] 。解决这一问题的关键…     

大鼠肝癌MRI、DSA与病理对照研究

目的探讨大鼠肝癌和诱发肝癌模型MRI、DSA的成像技术及影像特点,建立肝癌实验模型.材料和方法将CBRH3癌组织块接种在大白鼠肝脏不同部位和二乙基硝胺诱发肝癌模型,分别在癌肿形成后,行MRI、DSA检查及癌组织镜检,观察其影像学表现并和病理进行对照分析.结果接种癌T1WI呈低信号,T2WI呈较均匀高信号,DSA表现为环形异常血管染色;诱发癌T1WI呈均匀或不均匀低信号(10例),T2WI呈等或略高信号8例,呈低信号2例.结论接种癌影像学表现和人体转移性肝癌相类似,可作为转移性肝癌之实验模型;而诱发癌影像表现和人体原发性肝癌相类似,可作为原发性肝癌之实验模型.     

导入免疫效应蛋白基因增强自然杀伤细胞抗肝细胞癌作用的研究

目的 观察民入免疫效应蛋白NKG5－SV基因增强肝癌患者自然杀伤（NK）细胞抗肝细胞肝癌的效应。方法 以逆转录病毒为载体,将NKG5－SV导入肝癌患者的NK细胞,MTT法检测不同NK细胞的杀伤活性,测量小分子DNA片段定量检测凋亡。以LCI－D20裸鼠人肝癌转移模型为材料,研究肝癌切除术中脾内或切缘注射生理盐水、NK－LacZ细胞、NK－NKG5－SV细胞对肝癌切除术后转移复发的影响。结果 与NK细胞相比,NK－NKG5－SV细胞对SMMC－7721、HepG2肝癌细胞的杀伤活性明显增强,而K－LacZ细胞则无明显改变。对LO2细胞的杀伤活性和诱导SMMC－7721细胞凋亡产生的降解DNA三种NK细胞组无区别。术中无论切缘注射还是脾注射,NK－NKG5－SV细胞组肝癌肝内和远处的复发转移均少于对照组和NK－LacZ细胞组。结论 转染NKG5－SV基因的NK细胞对肝癌细胞的杀伤能力明显增强,肝癌切除术中无论切缘注射还是脾内注射均可抑制肝癌切除术后在转移复发。     

复制缺陷的重组腺病毒经心包腔转染急性心肌梗死猪观察

目的:评价重组腺病毒经心包腔转染的效率及持续时间.方法:应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ).12头中国小型猪随机等分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内注射转染,28 d后处死.实验组胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109噬斑集落形成单位;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.于注射后3 d、7 d及28 d分别对缺血心肌进行HE、HBFP及X-gal染色.结果:冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理学检查显示心肌有缺血和梗死.实验组注射Ad-LacZ基因后第3 d、7 d及28 d后X-gal染色有阳性细胞,以7 d最明显,对照组28 d内均未发现阳性细胞.结论:应用球囊堵塞法可成功建立猪急性心肌梗死模型,胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,腺病毒载体可转染缺血心肌,并持续表达4周.     

烷化剂的调节

骨髓移植疗效主要受预处理方案限制,而预处理方案中又以烷化荆为主,因此提高烷化剂疗效可望影响预处理方案的效果及其治愈的可能性。调节剂本身通常是一种无毒性、但能调节药物化学药理的某个方面从而提高疗效的化合物。本文扼要地介绍了烷化剂的调节剂。细胞膜有些烷化剂,尤其是氮芥和苯丙酸氮芥是主动转运进入细胞浆的。对这些药物耐药的细胞系其转运减少。氮芥和苯丙酸氮芥的正常底物分别为胆碱和苯丙酸。这两个底物能与各自烷化剂竞争细胞膜的转运,从而减低其细胞毒性。但迄今尚无临床前的实验证明该疗法的优点。     

血管抑素在肿瘤治疗中的应用

血管抑素是血浆纤维蛋白溶酶原裂解产物，能够抑制内皮细胞的增生和迁移，在体内抑制新生血管形成，对多种肿瘤均有抑制作用。有无毒性作用和耐药性。在肿瘤抗血管形成治疗中前景良好，目前尚不能大量生产应用于临床，联合传统治疗方法和基因治疗可能克服现在的困难。     

PREPARATION OF GENE-VIRAL THERAPEUTIC SYSTEM CNHK200HA AND ITS ANTITUMOR ACTIVITY ON LUNG CANCER

Objective： To develop a novel adenoviral vector system, which combines the advantages of the antiangiogenic gene therapy and virus therapy, and to investigate its antitumor activity on lung cancer. Methods： A new kind of viral vector CNHK200, in which the Elb55kDa gene was deleted and the whole Ela gene was preserved, was constructed. Human angiostatin gene Kringle 1-5 （hA） was amplified and inserted into the genome of the replicative virus CNHK200, generating CNHK200-hA. The expression of hA and its effect on lung cancer cell growth in vitro and in vivo were studied. Results： The novel vector system CNHK200-hA, just like the replicative virus ONYX-015, replicated in p53-deficient tumor cells but not in normal cells, and thus specifically killed tumor cells. In in vitro experiment, both CNHK200-hA and the non-replicative virus Ad-hA could kill tumor cells but the latter needed 100 times more MOI to achieve the same level of cell killing. In in vivo experiment, the therapeutic effect of CNHK200-hA on human lung cancer A549 xenografts in nude mice was significantly better than that of Ad-hA or that of ONYX-015. Conclusion： CNHK200-hA, which carries the angiostatin gene, has the advantages of specific tumor targeting, high expression of transgene in tumor cells and potent antitumor activity.     

携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的腺病毒载体的构建及体外抗肿瘤活性的研究

目的　构建携带人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)基因的腺病毒载体 ,评价TRAIL对人肺癌、肝癌细胞的基因治疗功效。方法　构建携带人TRAIL基因的腺病毒Ad hTRAIL ,感染人肺癌细胞株H 460、A5 49,人肝癌细胞株Hep3B、HepGII以及人正常肝细胞株WRL 68,人正常成纤维细胞株MRC 5 ,通过酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测hTRAIL的表达 ,并进行四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测其杀伤肿瘤细胞的效能。结果　成功构建携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒载体Ad hTRAIL ,感染H 460、A5 49、Hep3B、HepGII、WRL 68细胞 ,72h后上清中TRAIL表达量分别为 3 2 .75、2 4.5 3、3 4.0 2、3 2 .89、17.0 8μg/L。在MOI =1时 ,Ad hTRAIL即可引起肿瘤细胞明显凋亡 ,而在MOI =10 0时对正常细胞WRL 68、MRC 5也没有明显杀伤作用。结论　腺病毒载体携带人TRAIL基因在肿瘤基因治疗方面有非常广阔的应用前景。     

脾内转染白细胞介素-2和/或12基因增强接种肝癌大鼠T细胞功能研究

目的　探讨脾内直接注射白细胞介素IL 2、12基因对血IL 2和IL 12 ,以及T细胞活性的影响。方法　构建IL 2和或IL 12基因的逆转录病毒载体。含IL 2和或IL 12基因的包装细胞于不同时间进行脾内注射转染脾细胞。比较大鼠血IL 2和IL 12浓度、T细胞活性和毒性反应。结果　IL单基因治疗后血清IL 2或IL 12明显增高。IL 2 /IL 12联合基因组中血清IL 2和IL 12增加较单基因组显著。病理示肝癌组织中淋巴细胞浸润明显增多。IL治疗组治疗后 7d ,T细胞活性较对照组显著增高 (P <0 .0 5 )。联合基因组治疗后 7d ,T细胞功能较IL单基因组增强(P <0 .0 5 )。结论　脾内直接注射IL 2和或IL 12基因可增强T细胞活性 ,IL联合基因治疗优于IL单基因。