鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌聚合酶链反应方法的建立及应用

目的建立鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌IctrA/I基因变异区序列,设计合成PCR引物,分别用于扩增29E群、X群和Z群等3个血清群脑膜炎奈瑟菌。并将该方法应用于41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本的检测。结果3对引物分别能够特异性PCR扩增29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株的IctrA/I基因,扩增片段大小分别为667 bp、525 bp和667 bp,3个血清群之间以及与其他血清群脑膜炎奈瑟菌之间未出现交叉PCR扩增。41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本中,29E群和X群PCR阳性的标本分别有7份和2份,未检测出Z群菌株。结论本研究建立的PCR方法能准确、特异地鉴定29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

杜莫氏军团菌对上皮细胞A549粘附侵袭和胞内生长能力的研究

目的探明杜莫氏军团菌(Legionella dumoffii, L. dumoffii) 对上皮细胞A549的粘附、侵袭和胞内生长能力。方法实验使用菌株为L. dumoffii TEX KL(ATCC 33343) 、 L. dumoffii NY23(ATCC 33279)和嗜肺军团菌L. pneumophila philadelphila 1(ATCC 33155)。配制1×108菌悬液,将其以100MOI（Multiplicity of Infection）的比例与肺泡上皮细胞A549相互作用。通过吉曼尼兹染色和菌落计数的方法,测定菌株的粘附、侵袭和胞内生长能力。结果杜莫氏军团菌L. dumoffii TEX KL、L. dumoffii NY23和嗜肺军团菌L. pneumophila philadelphila 1三株细菌在体外生长能力和体内对A549细胞的粘附能力方面无明显差别。L. dumoffii TEX KL侵袭进入细胞内的菌数是其他两株菌的1 000倍,差异有统计学意义。结论 L. dumoffii TEX KL与L. dumoffii NY23和嗜肺军团菌L. pneumophila philadelphila 1相比,对A549细胞具有更高的侵袭力,因此也具有较高的上皮细胞内生长能力。     

肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型技术的联合应用

Objective To type Klebsiella pneumonia through methods including pulse-field gel electrophoresis (PFGE) in combination with multilocus sequence typing. Methods Four selected different Eps, referring to the Standard Operating Procedure of PulseNet China, were used. The single colony of Klebsiella pneumonia was quantified after enriched culture. Embedding organisms in agarose and genome DNA were lysed with Proteinase K and then digested by restriction endonuclease Xba Ⅰ , to produce agarose gel. Fingerprint was obtained through PFGE and bands were marked with their molecular weights and then analyzed by BioNumerics software. Using MLST to analyze the strains that were highly similar, by PFGE typing Results By comparing the four results from each Eps, fk3 (switch time from 6s to 36s,total run time is 18.5 hours) seemed to be better than the others.59 strains of Klebsiella pneumonia were divided into 47 PFGE types and 19 PFGE clusters. The highly similar strains could be typed into ST-340、ST-342、ST-343、ST-344、ST-345 by MLST. Among them, ST-342、 ST-343、 ST-344、 ST-345 types were all new MLST types that were reported in China.Conclusion Highly similar Klebsiella pneumonias typed by PFGE could also be typed by MLST.     

MLVA方法在军团菌分子分型中的应用评价

目的 探讨MLVA方法在军团菌分型中的可应用性。方法 选用文献报道的9个军团菌VNTR位点,对我国环境水中分离的81株Lp1型军团菌菌株和2株参考菌株进行分子分型研究,并与PFGE和SBT分型结果进行了比较。结果 81株分离菌株9个VNTR位点的等位基因型别数分别为1,3,4,2,3,3,2,4和7,其中部分菌株的某些位点无扩增产物或产物为非目的片断。7个位点PCR产物具有重复单元;Lpms3位点PCR产物无重复单元;Lpms31位点部分菌株PCR产物有重复单元,另一些菌株无重复单元。对于具有重复单元的序列,不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大,3个位点存在不完整的重复单元。根据8个位点的PCR产物电泳结果,81株Lp1型分离菌株分为19个MLVA型。通过PFGE和SBT方法,81株Lp1型分离菌株分别分为46种PFGE带型和21种ST型。结论 MLVA方法的分型能力不及PFGE方法,而与SBT方法分型能力相当。但是,MLVA方法操作简单、成本低廉,而且可对培养阴性的标本进行分型,因此,该方法适合在基层推广应用。     

241株肺炎链球菌血清分型及耐药性研究

目的了解肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S．p）对常用抗菌药物的敏感性及血清型构成。方法采用纸片扩散法检测241株S．P对6种常用抗菌药物的敏感性;采用荚膜肿胀试验对菌株进行血清学分型。结果241株s．p对利福平、米诺环素、氧氟沙星、复方新诺明、阿奇霉素、氯霉素的耐药率分别为0．41％、77．18％、0％、78．00％、95．44％、22．00％。229株S．P可分为24个血清型／群,主要的流行血清型／群为19F、6B、19A、23F、15、14、6A、3、6C;12株s．p未能分型。多重耐药菌株分布在6B、19A、19F、23F血清型。结论S．P的耐药情况严重,大多数菌株呈多重耐药特征。     

206株中国环境分离嗜肺军团菌1型菌株基因序列分型研究

目的 对中国不同自然环境来源分离的嗜肺军团菌血清1型菌株进行分子分型和种群结构分析。方法 应用7个基因(flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA、neuA)序列分型方法(Sequence based typing,SBT)对不同环境来源的206株嗜肺军团菌血清1型菌株进行分型研究,通过查询嗜肺军团菌SBT数据库(http://www.ewgli.org)和用BioNumerics软件构建最小生成树揭示菌株的分子分型和种群结构特征。结果 206株菌分成54个ST型(IOD=0.7205)。其中49株温泉水分离株分成25个ST型(IOD=0.9498),各位点Nei指数 0.7721~0.8563;130株冷却塔水分离株分成31个ST型(IOD=0.6453),各位点Nei指数为0.4227~0.4970;27株管道水分离株分成3个ST型(IOD=0.1453),各位点Nei指数为0.1425~0.1453。ST1型含108株菌,占52.4%,是优势带型。54个ST型形成5个克隆群。通过中国菌株和其他20个国家的菌株综合分析,共计1199株菌分成304个ST型,形成21个序列群。其中ST-1型为全球优势型别,其余型别和序列群呈地区性分布特征。结论 中国环境分离的嗜肺军团菌1型菌株具有高度复杂的基因多态性和种群结构,其中ST1是我国也是全球环境菌株的优势型别。     

湖北省22株B群脑膜炎奈瑟菌分子分型分析

湖北省自2006年以来多次出现B群流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例,健康人群B群菌株的带菌率也很高,占96.56％[1].本研究对湖北省2006-2010年流脑病例和健康人群分离的22株B群脑膜炎奈瑟菌(Nm)菌株进行分析.