PPM1A和P-Smad2在原发性肝癌中表达及意义研究

目的探讨肝癌及癌旁组织中P-Smad2蛋白与PPM1A的表达及意义。方法采用免疫组织化学技术检测31份肝癌（HCC）、25份癌旁组织及13份非癌性肝组织中P-Smad2蛋白和PPM1A的表达。结果①癌旁和病理分级小于Ⅱ级的癌组织中PPM1A表达以核为主，胞浆表达弱或不表达，病理分级大于Ⅲ级及以上的癌细胞中则以胞浆表达为主。正常、慢性肝炎和肝硬化组织中，PPM1A表达以核为主，胞浆无表达，差别有统计学意义（P〈0．05）。②P-Smad2在正常肝细胞、慢性肝炎、肝硬化、癌旁和病理分级Ⅰ-Ⅱ级的癌组织中表达以胞核和胞浆明显，胞浆表达主要聚集在核周，病理分级分级Ⅱ-Ⅲ级及以上的癌组织中，P-Smad2表达则以核为主，差别有显著性（P〈0．05）。③PPM1A和P-Smad2在癌组织的表达部位呈现负相关性（r=-0．345，P=0．001）。结论PPM1A与P-Smad2在肝癌组织的胞核和胞浆表达转位及强度与其组织病理改变有密切关系，二者可能通过其相互作用。共同参与肝癌的发生发展机制。     

土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的：构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1和H2亚基糖基识别域（CRD）的原核表达质粒，体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法：RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA，将其克隆至原核表达载体pRSET-B中，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2，目的蛋白可以高效表达，用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽，且纯度高，免疫原性强，用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高，为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT-PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA-APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1.3倍HBV载体pHBV1.3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

丙型肝炎诊断技术的合理应用

在介绍HCV抗体检测的血清学方法6年后,检测技术已经有了十分明显的进步。第三代ELISA试剂含有4～5个结构或非结构蛋白的片段,提高了抗体检测的敏感性和特异性。已经建立了几种检测非特异性反应的验证实验方法。急性或慢性HCV感染时的病毒血症可用RT-PCR检测,然而,对系列血清PCR结果的可靠性研究表明,十分迫切要求PCR技术的规范化。     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg1～149aa）的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原（1～149aa）纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。     

转甲状腺素蛋白含量及化学修饰在肺癌诊断中的价值

目的研究血清和腹水转甲状腺素(TTR)蛋白含量和化学修饰类型,在肺癌诊断中的作用。方法日本东芝TBA120全自动生化分析仪测定血清和胸水总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、乳酸脱氢酶(LDH)及葡萄糖(GLU)的含量。免疫比浊法测定TTR、Apo A和Apo B三种蛋白含量。基〗结果胸水中有6种成分含量比血清明显减低,减低程度明显的顺序依次是:TG、TC、Apo A、Apo B和TTR,而增高的仅LDH一项指标。在蛋白指标中TTR减低最明显。肺癌患者胸水TTR发生3种类型化学修饰,其中GLUT-TTR修饰型明显增高。结论肺癌患者胸水TTR含量明显低于血清,并且glut-TTR修饰比例明显增高,可能作为肺癌诊断的辅助参考指标。     

用大鼠模型评价齐多夫定及阿德福韦酯对线粒体的毒性损伤

目的 用大鼠模型评估齐多夫定(AZT)及阿德福韦酯(ADV)对线粒体的毒性损伤.方法 SD大鼠随机分为AZT、ADV和空白对照三组,连续灌胃给药28d,检测大鼠肝、肾、骨骼肌、心肌线粒体的细胞色素c氧化酶活性、细胞色素b基因含量,及用电子显微镜观察各组织线粒体超微病理结构的改变情况.对数据进行方差分析或非参数检验的Kruskal-wallis检验. 结果 AZT组大鼠细胞色素c氧化酶活性(单位为U/mg)在肝、肾、心肌和骨骼肌分别为9.44±3.09、4.42±1.53、32.74±5.52、33.75±8.74,低于空白对照组的17.8±12.38、14.45±13.75、24.74±20.59、40.04±2.49,也较ADV组低,但三组间的差异均无统计学意义(肝脏:H=3.08,P=0.21;肾脏:H=3.44,P=0.18 ;骨骼肌:H=1.61,P=0.45;心肌:H=2.52,P=0.28).AZT组大鼠线粒体细胞色素b基因含量在肝脏、心肌分别为0.61±0.95、0.15±0.13,ADV组分别为0.52±0.68、0.17±0.08,相比空白对照组明显减少,但差异无统计学意义(肝脏:H=3.398,P=0.18;心肌:H=0.33,P=0.85).AZT组的肝、肾、骨骼肌和心肌都出现明显的线粒体损伤改变.结论 连续给药28 d后,AZT可造成明显的线粒体损伤,而ADV仅导致线粒体细胞色素b基因含量偏低.