婴儿细菌性结膜炎常见病原分析

结膜炎是小儿尤其是婴儿结膜感染的常见疾病,衣原体、细菌和病毒均是婴儿结膜炎常见的感染原.为了解本地区婴儿细菌性结膜炎的常见致病菌及其对临床常用抗生素的敏感情况,对就诊的患儿进行结膜囊分泌物培养及药敏试验,现将结果报告如下.     

婴儿巨细胞病毒感染的分子生物学诊断研究

目的评价婴儿巨细胞病毒感染中聚合酶链反应(PCR)加限制酶分析的应用价值.方法在巨细胞病毒(CMV)DNA多聚酶基因中设计一对引物,对CMV进行PCR扩增、分子克隆、序列分析后,选择BstUI进行酶切以鉴别扩增产物.结果巨细胞病毒PCR扩增后产物为592bp,经BstUI酶切后证实为CMVDNA,其最小检出量为0.1fg,与乙肝病毒、真菌、细菌和人类基因组无交叉反应.用该方法检测临床32份血和5份脑脊液标本中的CMV,12份血和1份脑脊液标本阳性;同时用ELISA法检测血标本,5例阳性.PCR阳性检出率为37.5%,ELISA为15.6%(P＜0.05).9例诊断为CMV感染患儿经更昔洛韦治疗10～14天后,复查外周血巨细胞病毒DNA,有1例仍为阳性.结论 PCR加限制酶分析能提高婴儿巨细胞病毒感染的诊断率.更昔洛韦可作为抗CMV感染的有效药物.     

人疱疹病毒6型荧光定量分型方法的建立和临床应用

Objective Human herpesvirus 6(HHV-6)isolates are classified into two variants,HHV-6A and HHV-6B,based on distinct genetic,antigenic and biological characteristics.HHV-6 has been associated with encephalitis in children recently.This study aireed to estabhsh a real time PCR assay for simultaneous detection of the two subtypes of HHV-6,and apply this new assay to children with suspected encephalitis,then analyze the relationship between the infeetion with HHV-6 and encephalitis in children.Method The universal primers and variant-specific TaqMan probes were designed based on the highly conserved sequences of the DNA polymerase gene(U38)of HHV-6.The 5'end of the probes for HHV-6A and HHV-6B was labeled with the fluoreseein reporter tetrachloro-6-carboxyfluorescein and 6-earboxyfluorescein(6-FAM),separately,while the 3'end were quenched with 6-carboxy-tetramethyl-rhedamine.The real time PCR assay for simultaneous detection of HHV-6A and HHV-6B was established.Then,the plasmids of HHV-6A and -6B which were diluted by a 10-fold series from 109 to 10°copies/μl,together with controls were used for testing both sensitivity and specificity of the real time PCR assay.The cerebrospinal fluid(CSF) specimens from 445 cases of suspected encephalitis were tested with this real time PCR and positive samples were then sequenced.Result Both HHV6A(strain ZJ-159)and HHV-6B (strain GS)were positive on the real time PCR assay.There were no cross-reaction with herpes simplex virus type 1,type 2(HSV-1,HSV-2),varicella-zoster virus(YZV),cytomegalovirus(CMV),EpsteinBarr virus(EBV),hepatitis B virus,Staphylococcus aureus,Mycoplasma pneumoniae and human DNA.A linear regression curve was obtained when plotting Ct values against the log10 of the viral DNA input for both subtypes of HHV-6.The sensitivity threshold was 10 copies/μl for the real time PCR.HHV-6 positive rate by the real time PCR assay was 4.72%(21/445),including 4 ca8es with HHV-6A infection,16 cases of HHV-6B infeedon and l case with mixed HHV-6A and HHV-6B infeetion.The new PCR assay usually took 2 to 3 hours to provide results.Conclusion This new real time PCR assay call simultaneously detect both subtypes of HHV-6,and have high specificity and sensitivity.It will pmvide an early and sensitive diagnosis of HHV-6 encephalitis in children.     

蒙古族与回族人群甘露糖结合凝集素基因启动子单体型分析

目的分析内蒙古自治区蒙古族人群和宁夏回族自治区回族人群甘露糖结合凝集素（MBL）基因启动子区和5’端非翻译区的单核苷酸多态性（SNP）及其单体基因型。方法MBL基因SNP分析采用序列分析法；遗传学分析采用SHEsis软件。结果79例蒙古族人群中启动子-550位点H／H、H／L和L／L型分别占38．0％、45．6％和16．5％，等位基因变异频率为0．392；-221位点Y／Y和X／Y型分别占81．0％和19．0％，等位基因突变频率为0．095。69例回族人群中启动子一550位点H／H、H／L和L／L型分别占36．2％、44．9％和18．8％，等位基因变异频率为0．413；-221位点Y／Y和X／Y型分别占75．4％和24．6％，等位基因突变频率为0．123。启动子单体型有HYP、LYP和LXP3种，在蒙古族人群中的频率分别为0．608、0．297和0．095；回族人群中的频率分别为0．587、0．290和0．123。所有样本5’端非翻译区＋4位点均无突变即均为P型。蒙古族和回族-550位点和-221位点的变异频率差异无统计学意义（χ^2-550=0．131，P=0．718；χ^2-221=0．610，P=0．435）。结论（1）本研究中蒙古族和回族人群启动子单体型仅HYP、LYP和LXP3种。（2）启动子区-550位点的变异频率较高，-221位点变异频率较低，＋4位点无SNP发现。两组人群上述位点的变异频率差异无统计学意义。     

脑脊液细菌16S rRNA荧光定量PCR快速诊断儿童化脓性脑膜炎

目的探讨儿童化脓性脑膜炎(化脑)新的快速诊断方法。 方法2003 08—2005 12采用16SrRNA荧光定量法对浙江大学儿童医院49例临床疑似化脑患儿脑脊液(CSF)的细菌DNA进行测定；监测化脑患儿脑脊液细菌DNA拷贝数，同期进行CSF细菌培养的对照。 结果(1)荧光定量PCR(FQ PCR)检测49份脑脊液标本发现17份阳性，阳性率为34.7%(17/49)，明显高于脑脊液培养的阳性率10.2%(5/49)，差异具有显著性(P<0.01)。(2)对17份FQ PCR阳性标本进一步测定细菌DNA的拷贝数，发现患儿病情与其DNA拷贝数呈正相关，与其Ct值(指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)呈负相关，Ct值越低，脑脊液细菌DNA拷贝数越高，患儿的预后越差。(3)FQ PCR、CSF细菌培养同时阳性的仅为5例。(4)对2例脑脊液FQ PCR的产物测序，Ct值17.9的测序提示为大肠埃希菌，符合CSF细菌培养结果；Ct值31.8的，测序未果。 结论荧光定量PCR特异性强、敏感性高，需标本量少，是早期快速诊断儿童化脑的可靠方法，具有较大的应用价值。     

人疱疹病毒分子生物学诊断的研究进展

人疱疹病毒是免疫功能低下者及儿童感染的常见病原体，其实验室诊断对临床至关重要。近10多年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基因诊断方法如核酸分子杂交技术、PCR技术、生物芯片技术等得到不断发展和应用，该文就近年来国内外在人疱疹病毒分子生物学诊断方面的研究现状及进展作一综述。     

套式聚合酶链反应检测各孕期孕妇巨细胞病毒感染

目的评价套式聚合酶链反应（ＮＴ－ＰＣＲ）加限制酶切分析在各孕期人类巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）感染检测中的应用。方法ｈＣＭＶ检测采用病毒分离、血清学试验、ＮＴ－ＰＣＲ加限制内切酶谱分析。结果３６７例孕妇中孕早、中、晚期ｈＣＭＶ阳性检出率分别为８．６％、１．６％及７．０％。经ＮＴ－ＰＣＲ检测，１８例ｈＣＭＶＤＮＡ阳性，阳性率为４．９％，而病毒分离，特异性ＩｇＭ及ＩｇＡ阳性率分别为３．０％、１．１％及２．２％。ＮＴ－ＰＣＲ阳性检出率高于病毒分离等其它方法（Ｐ＜０．０２５），与ＰＣＲ法比较，病毒分离特异性为１００％，敏感性为６１．１％，近３０％ｈＣＭＶ感染的孕妇ＰＣＲＤＮＡ阳性，表现为ＤＮＡ血症。结论ＮＴ－ＰＣＲ能早期检出孕妇ｈＣＭＶＤＮＡ，对孕妇ｈＣＭＶ感染的监控有重要意义。     

肺炎链球菌感染儿童血浆甘露糖结合凝集素水平分析

目的了解肺炎链球菌感染儿童血浆甘露糖结合凝集素表达水平的变化，比较健康组和肺炎链球菌感染组血浆MBL浓度的差异。方法血浆MBL浓度的检测采用ELISA法。统计分析采用SPSS软件11．0版。不同人群间MBL浓度比较采用非参数检验。结果MBL浓度分布为非正态分布资料，105例健康儿童血浆MBL浓度范围为3ng／ml-6，025ng／ml和49例肺炎链球菌感染儿童血浆MBL浓度范围为0—6，544ng／ml，中位数分别为1，057ng／ml和1，307ng／ml，肺炎链球菌感染儿童血浆MBL浓度明显高于健康儿（Z（=2．236，P=0．025）。健康组和感染组血浆MBL浓度低于200ng／ml的个体分别占5．71％和10．2％，两者间差异无统计学意义（Х^2=1．02，P〉0．05）。结论本研究未能证明肺炎链球菌的易感性与血浆MBL浓度的相关性。     

融合蛋白表达质粒pUL54S-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达

目的 探讨构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54(UL54S)基因融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pUL54S-EGFP转染人胚肾293细胞,瞬时表达UL54S和EGFP的可行性.方法 采用PCR法扩增UL54s基因并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,采用脂质体法转染AD293细胞后通过荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的表达情况.结果 重组质粒pUL54S-EGFP转染AD293细胞12h后即可见到荧光蛋白的表达,至48h表达达高峰;转染48h pUL54S-EGFP组平均转染率为47%.平均荧光强度为547.结论 重组质粒pUL54S-EGFP可在人胚肾293细胞内瞬时表达UL54S和EGFP融合蛋白,EGFP的表达可报告UL54基因的表达,质粒pUL54S-EGFP构建成功.     

干滤纸血片制备环境的理化因素对实验结果的影响

目的观察新生儿疾病筛查干滤纸血片(dried blood spots)制备环境中显著影响实验结果的理化因素。方法研究组1:收集正常标本60例、阳性标本120例,于对照条件及10种特定环境下制备干滤纸血片。研究组2:另收集正常标本30例、阳性标本80例,于对照条件及7种甲醛浓度环境下制备干滤纸血片。用荧光法或时间分辨荧光免疫分析法检测标本中苯丙氨酸(Phe)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、促甲状腺激素(TSH)、17α-羟孕酮(17α-OHP)水平。用SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果 10种环境下制备的干滤纸血片Phe检测结果与对照组差异无统计学意义(P0.05),甲醛敏感阈为4.62~6.95 ppm/18 h;37℃烘箱、潮湿、紫外线照射、新装修环境、乙醇、冰醋酸、甲醛等环境下制备的干滤纸血片G6PD检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为0.30~0.38 ppm/4 h及0.21~0.24 ppm/18 h;潮湿、紫外线照射、甲醛环境下制备的干滤纸血片TSH检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为0.32~0.52 ppm/4 h及0.38~0.45 ppm/18 h;潮湿、紫外线照射、甲醛环境下制备的干滤纸血片17α-OHP检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为4.37~4.62 ppm/4 h及0.38~0.45 ppm/18 h。冷风快速吹干与2~8℃冷库环境下制备干滤纸血片4项检测结果与对照组差异均无统计学意义(P均0.05)。结论干滤纸血片制备环境的理化因素与新生儿疾病筛查的准确性密切相关,甲醛、乙醇、冰醋酸、紫外线照射、高温、潮湿及装修污染等是干滤纸血片制备环境的必要管控因素;冷风快速吹干与2~8℃冷库过夜可作为新生儿筛查干滤纸血片制备的备选方法。