四川株多房棘球绦虫elp基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的　实现多房棘球绦虫elp基因在原核中的表达 ,为进一步研究多房棘球绦虫ELP抗原的诊断及免疫保护性提供前提条件。方法　应用RT -PCR方法从中国四川株多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因编码序列 ,克隆测序后亚克隆于含有硫氧环蛋白 (Trx)基因的高效原核表达载体pET32a(+)。经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ELP/Trx融合蛋白。SDS -PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP/Trx融合蛋白 ,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果　酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列插入 pET32a(+)的多克隆位点 ,成功地构建了pETrx -ELP融合蛋白原核表达载体。SDS -PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了ELP/Trx融合蛋白。检测 10份包虫病人血清均阳性 ,10份肝吸虫病、10份乙肝病人和 10份健康人血清均为阴性。结论　中国四川株多房棘球绦虫elp基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,初步实验结果显示该融合蛋白对包虫病具有诊断价值。     

腹腔镜保守性手术联合GnRH-a反减疗法治疗子宫内膜异位症

目的探讨腹腔镜保守性手术后采用降低促性腺激素释放激素激动剂(GnRh-a)的剂量治疗子宫内膜异位症的疗效及其副作用。方法将腹腔镜保守性术后60例子宫内膜异位症患者随机分两组,对照组30例接受GnRh-a亮丙瑞林治疗,3.75mg,每28d1次,连续6次;观察组30例先给予亮丙瑞林3.75mg,每28d1次,连续3次后减为半量(即1.88mg),再连续3次。结果两组患者治疗后痛经、盆腔痛均较治疗前降低。治疗结束时对照组与观察组中潮热、多汗等低雌激素症状中-重度发生率分别为83.33%和26.67%,差异有统计学意义(P<0.01);对照组较治疗前腰椎骨密度明显降低,平均骨丢失5.0%,观察组平均骨丢失为1.2%。用药8周后两组血雌二醇(E2)和CA125水平均明显降低,对照组血E2波动与观察组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论以GnRH-a治疗子宫内膜异位症,在垂体功能完全抑制后将用量减半,既可使异位的子宫内膜发生萎缩,同时减轻了因卵巢功能进行性抑制而引起的潮热和骨丢失。     

siRNA腺病毒抑制Survivin基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的为改进质粒siRNA载体的不足,建立siRNA的病毒性载体系统,并探讨凋亡抑制因子Survivin基因在肝癌细胞中的作用。方法通过已建立的Survivin质粒siRNA,构建Survivin的腺病毒siRNA载体系统,筛选重组病毒并感染肝癌细胞HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Survivin基因表达变化,用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡。结果成功构建Survivin基因的腺病毒siRNA载体及重组腺病毒,感染肝癌细胞明显抑制Survivin蛋白表达,抑制率66.32%;降低Survivin基因的mRNA转录水平达72.04%;应用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡明显增加。结论腺病毒siRNA载体系统可作为抑制目的基因,进而研究其功能和作用的技术平台,并为其他基因的相关研究打下基础;抑制Survivin基因表达可诱导肿瘤细胞HepG2的凋亡,为今后腺病毒siRNA载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

丙型肝炎病毒编码蛋白的生物学功能

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的传染性疾病.是慢性肝病的主要原因之一,本文系统阐述病毒编码蛋白通过直接与细胞内重要调节分子结合,以病毒-宿主细胞相互作用方式影响细胞重要的信号通路,导致细胞增殖、分化等发生异常,干扰机体免疫防御功能,削弱宿主对HCV感染细胞的抗病毒应答,有利于慢性持续性感染的建立,最终促使HCV相关肝病的发生和发展.加强对病毒蛋白生物学功能的研究,将有助于探讨HCV致病机制和免疫逃逸机制,对HCV特异靶向药物和治疗性疫苗的研究和开发也具有重要的意义.     

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据.方法分离培养原代鸭肝细胞(PDH),电转线性HBVDNA(转染组,1.19×1012拷贝/1×107PDH)或急性感染DHBV(感染组,4×108病毒颗粒/1×107PDH),分别于转染/感染后ld、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg(采用IMX系统或ELISA检测);并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA.于转染/感染后2d提取PDH总DNA采用SouthemBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式.以单纯电击或未感染的PDH为对照组.结果转染后1d、3d和5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、14.55和5.13(P/N值,阳性≥2.1),HBeAg均为阴性;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为14.6、31.53、34.73(S/N值,阳性≥2.1);上述各项指标于对照组均为阴性.DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性,对照组为阴性;SouthernBlot分析显示转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型,可见4.0kb以下分子涂抹带,包括rcDNA、cccDNA(scDNA)和ssDNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子区(4～24kg)涂抹带.结论HBVDNA在PDH中的复制和表达与DHBV感染组相似,可能为肝细胞内环境依赖性,无严格种属特异性限制.     

腹腔镜与开腹子宫肌瘤剔除术的对比研究

[摘要] 目的 探讨腹腔镜子宫肌瘤剔除术的临床应用价值。方法 170例子宫肌瘤患者随机分为两组：腹腔镜组82例，开腹组88例。腹腔镜组采用腹腔镜下子宫肌瘤剔除术，与开腹组比较手术时间、术中出血量、术后肠功能恢复时间、术后病率、术后镇痛率、住院时间、术后复发与妊娠情况等。结果 腹腔镜组82例无中转开腹，有2例中转经阴式缝合完成。腹腔镜手术时间（86.4±20.1）min较开腹组（79.3±23.2）min延长（t=-3.432，p=0.000）；腹腔镜组术中出血量（94.6±30.5）ml与开腹组（99.8+28.7）比差异无显著性（t=1.847，p=0.069）；腹腔镜组术后肠功能恢复时间（18.4±6.5）h短于开腹组（26.6±6.8）h（t=-5.757，p=0.000）；腹腔镜组术后病率12例，显著少于开腹组30例（x2=8.638，p=0.000）；腹腔镜组术后住院时间（5.5±2.0）d短于开腹组（8±2.0）d（t=-10.564，P=0.000）；腹腔镜组术后镇痛率33例显著少于开腹组75例（x2=37.071，p=0.000）。术后随访全部病例，时间7~36个月，平均21个月，两组术后妊娠率、复发率的差异均无统计学意义。结论 腹腔镜子宫肌瘤剔除术具有开腹术式相同的效果，但更具有创伤小，出血不多，术后恢复快及住院时间短，并发症少等优点。 [关键词] 子宫肌瘤剔除术 腹腔镜 开腹     

两种不同疾病大子宫行腹腔镜辅助下阴式全子宫切除术554例临床分析

目的:探讨子宫体积≥12孕周的子宫肌瘤或子宫腺肌症,行腹腔镜辅助下阴式子宫切除术(LAVH)时的手术技巧及各自的手术特点。方法:回顾分析我院2003年1月至2006年12月因子宫肌瘤和子宫腺肌症需切除子宫,子宫体积在12~22孕周已行LAVH的病例554例。比较两者子宫重量、手术时间、术中出血量、副损伤,术后肛门排气时间、术后病率、住院时间。结果:两组子宫重量、术后住院时间、肛门排气时间、术后病率、术中副损伤无显著差异。比较手术时间、出血量差异显著(子宫腺肌症组比子宫肌瘤组手术时间长、出血量多)。术中无1例中转开腹,全部病例痊愈出院,术后随访1年,均无远期并发症发生。结论:只要术者具有熟练腹腔镜阴式操作经验、技巧,子宫腺肌症、子宫肌瘤患者子宫体积在12~20孕周者行LAVH是安全、可行、微创的,但子宫腺肌症手术难度比子宫肌瘤大。手术成功的关键是灵活应用各式阻断子宫血供的方法及熟练的碎宫技巧并根据自身实际操作经验和优势选择恰当适应症。     

泛昔洛韦治疗乙型肝炎相关疾病研究进展

本文就近两年泛昔洛韦用于治疗慢性乙型肝炎、肝移植术后预防乙型肝炎病毒(HBV)再感染的相关进展、长期治疗后出现的耐药突变以及其他核苷类似物的交叉耐药等问题作了综述。     

重组抗原CP4-EPSPS的表达及免疫学活性研究

目的：表达并纯化重组CP4-EPSP合成酶（CP4-EPSPS），研究重组CP4-EPSPS的免疫学活性；为进一步制备单克隆抗体和开发检测CP4-EPSPS的快速诊断试剂奠定基础。方法：诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS的重组载体pET-EPSPS。经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化，以ELISA、胶体金试条、Western杂交鉴定其免疫活性。结果：重组CP4-EPSPS以包涵体表达为主，上清表达量极低，但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS抗原活性强；复性包涵体的抗原性与上清的抗原性明显不同。采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法，从上清中纯化CP4-EPSPS获得成功，ELISA检测此重组抗原免疫小鼠血清抗体滴度可达到1：625，000；Western杂交证实重组抗原免疫血清与CP4-EPSPS标准品有较好的免疫反应性。结论：包涵体的简单复性方法难以恢复其关键的抗原决定簇的免疫原性；运用胶体金试纸条检测重组CP4-EPSPS活性，灵敏度高，简单快捷，对CP4-EPSPS特异检测相关的关键性抗原决定簇的甄别有重要作用，可指导重组抗原的纯化和在免疫学研究、特别是在单克隆抗体开发中的应用。     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子的活性

 目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)抑制分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)启动子活性的分子机制。方法:扩增不同长度的SFRP5启动子区片段，构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic上，并将构建好的重组质粒转染入正常肝细胞系LO2细胞，再分别感染编码HBx的腺病毒（Ad-HBx）或编码绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP），荧光显微镜下观察病毒感染效率，检测萤光素酶活性以观察HBx对SFRP5启动子活性的影响。结果:(1) 含不同长度的SFRP5启动子区截短突变报告质粒构建成功。(2) 截短突变报告质粒的萤光素酶活性与pGL3-Basic对照组相比，分别为(6.32±0.04)倍(-478 bp~+47 bp)、(5.79±0.32)倍(-811 bp~+47 bp)、(3.59±0.34)倍(-1 235 bp~+47 bp)、(3.86±0.39)倍(-1 677 bp~+47 bp)、(3.26±0.42)倍(-2 072 bp~+47 bp) (均P<0.05)。过表达HBx可以明显抑制SFRP5启动子活性，抑制率分别为44%(-478 bp~+47 bp) (P<0.05)、 46%(-811 bp~+47 bp) (P<0.05)、 28%(-1 235 bp~+47 bp)、 24%(-1 677 bp~+47 bp)和40%(-2 072 bp~+47 bp)。结论: HBx可以明显抑制SFRP5启动子区活性，可能导致SFRP5基因表达下调。