曲安奈德对人视网膜色素上皮细胞活性与 屏障功能的影响

目的观察曲安奈德 (TA)对人视网膜色素上皮（RPE）细胞活性与屏障功能的影响。方法用ARPE-19细胞，96孔板中培养至４周，加入不同浓度的TA（0.02、0.05 mg/ml），继续培养3 d或7 d，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞活性；将细胞培养在多聚酯滤膜上，４周时记录跨上皮电阻（TER），然后分别在培养液中加入0.02、0.05 mg/ml TA继续培养１周，再次测量TER，并以辣根过氧化物酶（HRP）作示踪剂、酶联免疫吸附试验（ELISA）法评价不同浓度TA组ARPE-19细胞的通透性。结果在含0.02 mg/ml TA培养液中培养3 d或7 d，细胞平均存活率分别为93.70%和90.63%，其细胞活性与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.147，0.091）；在含0.05 mg/ml TA培养液中培养相同时间后，细胞活性较对照组显著降低（平均存活率为87.75%、88.98%；P=0.025，0.043）；经过1周培养，2个处理组的TER与对照组相比均有极显著降低（P 均＜0.001）；两个处理组HRP的通透性均显著高于对照组（0.001＜P＜0.05）。结论TA可以使ARPE 19细胞的活性降低，并破坏其屏障功能的完整性。(中华眼底病杂志,2005,21:237-239)      

高糖对人视网膜色素上皮细胞Na-K-ATP酶表达的影响

目的 观察高糖对人视网膜色素上皮（RPE）细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达的影响。方法 采用ARPE-19细胞，培养4周后分为高糖组（葡萄糖浓度30mmol／L）与对照组（葡萄糖浓度7mmol／L），继续培养2周、4周，RT-PCR法检测Na-K-ATP酶α1、Na-K-ATP酶β1的mRNA表达水平的变化，Western blot法检测Na-K-ATP酶β的蛋白表达情况。结果 高糖抑制Na-K-ATP酶α1与β1的mRNA表达，2周、4周时α1与β-actin光密度比值分别为0．17、0．23，对照组分别为0．37、0．36；β1与β-actin光密度比值分别为0．69、0．41，对照组分别为0．98、0．83；Na-K-ATP酶β蛋白表达水平较对照组降低，2周、4周时与β-actln的比值分别为0．51、0．25，对照组分别为0．65、0．68。结论 高糖环境下人RPE细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达水平降低，可能参与了黄斑水肿的发生。     

转化生长因子β1对内皮细胞屏障功能的影响

目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）对体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926屏障功能的影响并探讨其作用机制。方法体外培养EA.hy926脐静脉内皮细胞株,实验分为两组,对照组培养液中加入PBS;TGF-β1处理组培养液中添加0.01mg/L的TGF-β1。将细胞在多聚脂滤膜上培养,测量细胞跨上皮电阻（TER）的变化。免疫荧光检测两组血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、α-连环蛋白、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和纤维连接蛋白的表达变化;RT-PCR检测两组VE-cadherin和VEGF表达的变化。结果TGF-β1处理后TER降低,两组处理前后TER差值比较有统计学意义（t=3.294,P〈0.01）;TGF-β1处理组VE-cadherin和α-连环蛋白表达减少,内皮细胞黏附连接被破坏;而VEGF和纤维连接蛋白表达增多,基底膜增厚。结论TGF-β1可引起内皮细胞屏障功能的破坏,其机制可能与VEGF的表达上调有关。     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。     

浅论基础免疫学研究新进展对眼科免疫学研究的启示

免疫稳态是维持机体生理健康的机制之一,免疫反应是引起或参与诸多疾病的病理过程.近年来国内外在免疫学的基础研究方面取得了较大进展,包括天然免疫机制的研究,树突状细胞（DCs）、T淋巴细胞及B淋巴细胞的亚群研究,微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（LncRNA）、表观遗传学对免疫功能的调控以及现代免疫学研究的新技术等,大大推动了临床免疫学研究的进步.眼是一个具有特定免疫学特征的重要器官,眼科多种疾病的病理机制涉及几大免疫学研究分支,如感染免疫、移植免疫、自身免疫、超敏反应等,因此基础免疫学的重大进展为研究眼科领域免疫学疾病的发病机制和防治策略提供了新的信息.此外,眼科免疫学是现代医学科学中研究十分活跃的领域,眼科免疫性疾病的研究成果可促进基础免疫学的重大科学问题研究.本文评述免疫学领域的最新进展趋势,并探讨其对中国眼科免疫学发展的启示.     

绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

目的 原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定.方法 分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列,设计带适当酶切位点的引物,用PCR方法扩增出 FlgE的编码DNA序列,与大肠杆菌表达载体pET24a同时经Nde Ⅰ/HindⅢ双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒,挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化,使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE对纯化后蛋白相对分子质量进行鉴定,用试剂盒进行去内毒素化处理.在体外培养人角膜上皮细胞系细胞,加入纯化的FlgE重组蛋白,培养4h后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性.结果 可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达,当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1 mmol/L,在16℃、225r/min振荡培养20 h,诱导目的蛋白表达量最高,经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE鉴定,获得纯化的重组FlgE蛋白.角膜上皮细胞用20 μg/ml FlgE处理后,细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升,而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性.结论 获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE,且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达.     

具有野生型活性和新活性的小鼠白介素12融合基因的构建与表达

天然白介素(IL)12是一种异二聚体分子,其工程产品只能在真核细胞内表达,因而产量低,造价高,限制了临床应用。根据融合蛋白的原理,结合IL-12本身的结构特点进行推断,若将IL-12的二亚基(p35/p40)适当改造和融合,其产物可能同样地表达野生型IL-12的活性,这将为在原核表达系统内表达融合蛋白提供先决条件。将p40亚基cDNA中编码Ig-样区域的序列缺失,残余部分与p35亚基的cDNA3’端通过连接序列连接,构成融合IL-12 cDNA(fmIL-12C)。当此融合基因克隆人真核表达载体pMT/EP后在CHO细胞内表达,其产物具有野生型IL-12的活性,即刺激活化淋巴母细胞增殖。与此同时,融合IL-12的cDNA的表达使CHO细胞发生十分明显的形态变化,提示融合IL-12可能具有一些新活性。对此融合基因进一步改造及在原核系统内表达的可能性也进行了讨论。     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的:检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSC)和视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物(BRE)以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果:BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE,Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论:RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。