封闭ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

目的:探讨通过封闭ERCC1基因表达干扰DNA损伤修复路径及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响.方法:构建ERCC1基因反义表达载体,转染人卵巢癌细胞A2780及A2750/CP70,采用Northern杂交及Western Blot分析人卵巢癌细胞内ERCC1基因RNA及蛋白表达水平变化;利用荧光素酶报告基因系统观察宿主细胞对DNA损伤的修复作用;采用MTT实验研究细胞对铂类药物耐药性的影响.结果:卵巢癌细胞转染反义ERCC1基因后,ERCC1基因转录水平、蛋白表达水平明显下降.荧光素酶报告基因系统结果证明,宿主细胞的DNA修复活性下降.MTT实验表明,伴随ERCC1基因表达水平下降,细胞对顺铂的耐药性降低.结论:转染ERCC1反义基因显著影响宿主细胞的核苷酸切除修复,影响细胞对顺铂的耐药性.     

深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

反复自然流产妇女和正常妇女FXⅢ Val34Leu基因多态性的检测

[目的]了解深圳地区反复自然流产妇女和正常妇女凝血因子XⅢ(FXⅢ)基因Val34Leu的多态性,探讨其与反复自然流产发病的关系。[方法]应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测57例反复自然流产妇女和153例正常妇女的FXⅢ Val34Leu基因多态性。[结果]反复自然流产组与正常对照组均不存在FXⅢ Val34Leu的突变。[结论]深圳地区正常妇女和反复自然流产妇女FXⅢ Val34Leu的突变频率很低,FXⅢ Val34Leu的突变可能不是引起反复自然流产发病的重要原因。     

PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与反复自然流产相关性的研究

目的:探讨纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因启动子区4G/5G插入和缺失多态性与反复自然流产的相关性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术检测57例反复自然流产患者和153例对照组PAI-1基因启动子区4G/5G多态性,并进行比较。结果:反复自然流产组PAI-1基因型频率和等位基因频率分布:4G/4G为26.3%,4G/5G为54.4%,5G/5G为19.3%,4G等位基因频率为0.535,5G等位基因频率为0.465;对照组PAI-1基因型频率和等位基因频率分布:4G/4G为21.6%,4G/5G为56.2%,5G/5G为22.2%,4G等位基因频率为0.497,5G等位基因频率为0.503,经统计学处理,两组各基因型和等位基因频率均无显著性差异(P>0.05)。结论:PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与反复自然流产发病无明显的相关性。     

腺病毒感染及肥胖基因突变在肥胖发病中的作用

采用流行病学研究方法，应用分子病毒学技术，研究我国南方肥胖人群腺病毒36型（AD-36）的感染情况，同时结合分子生物学技术分析并比较正常及肥胖群体代谢相关基因解偶联蛋白（UCP）、p肾上腺素能受体（B3-AR）的基因多态性，检测人群瘦素及蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）含量、涪性，辅以问卷调查生活方式等，综合遗传、内分泌、环境等因素，全面评价AD-36在致我国人群肥胖发生中的作用，为探明肥胖病因及防治方法提供依据。     

卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子剪接变异及功能研究

目的　确认卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子剪接变异的存在 ,探讨该剪接变异对ERCC1基因表达的作用及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响。方法　采用Northern杂交及RNA酶保护分析确认人卵巢癌细胞内ERCC1基因调控区在RNA水平存在剪接变异。分别构建野生型及缺失VIII外显子的ERCC1表达载体 ,转染中国仓鼠卵巢 4 3 3B细胞 ,采用Westernblot检测ERCC1表达水平研究该剪接变异对ERCC1基因表达水平的影响 ,采用MTT和细胞克隆形成实验研究该剪接变异细胞对铂类药物耐药性的影响。结果　卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子存在剪接变异。Westernblot结果显示该剪接变异不显著影响ERCC1表达水平 ,但CHO 4 3 3B细胞MTT及细胞克隆形成实验表明 ,该剪接变异显著影响细胞对顺铂的耐药性。结论　本研究首次证明人卵巢癌细胞、组织ERCC1基因VIII外显子存在剪接变异 ,该变异不显著影响ERCC1基因的绝对表达水平 ,但影响细胞对顺铂的耐药性     

卵巢癌细胞ERCC1基因Ⅷ外显子剪接变异及功能研究

目的 确认卵巢癌细胞ERCC1基因Ⅷ外显子剪接变异的存在,探讨该剪接变异对ERCC1基因表达的作用及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响。方法 采用Northern杂交及RNA酶保护分析确认人卵巢癌细胞内ERCC1基因调控区在RNA水平存在剪接变异。分别构建野生型及缺失Ⅷ外显子的ERCC1表达载体,转染中国仓鼠卵巢43-3B细胞,采用Westemblot检测ERCC1表达水平研究该剪接变异对ERCC1基因表达水平的影响,采用MTT和细胞克隆形成实验研究该剪接变异细胞对铂类药物耐药性的影响。结果 卵巢癌细胞ERCC1基因Ⅷ外显子存在剪接变异。Western blot结果显示该剪接变异不显著影响ERCC1表达水平,但CHO 43-3B细胞MTT及细胞克隆形成实验表明,该剪接变异显著影响细胞对顺铂的耐药性。结论 本研究首次证明人卵巢癌细胞、组织ERCC1基因Ⅷ外显子存在剪接变异,该变异不显著影响ERCC1基因的绝对表达水平,但影响细胞对顺铂的耐药性。     

HIV-1 p24 gag 与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

目的：研究 Ｈ Ｉ Ｖ １ｐ２４ ｇａｇ 与 ｈ Ｉ Ｌ ２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ Ｈ Ａ）基因为侧翼,将编码人白细胞介素２（ｈ Ｉ Ｌ ２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２。结果：经间接免疫荧光试验、 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ ｇａｇ 蛋白和 Ｉ Ｌ ２蛋白,表达产物分子量分别为２４ ０００、１６ ０００。结论：这种重组痘苗病毒人表达外源蛋白的成功,为获得更强的免疫效果,研制 Ｈ Ｉ Ｖ 重组病毒活疫苗提供一种安全的新途径。     

维持性血液透析患者庚型肝炎病毒感染状况

目的 探讨庚型肝炎病毒合并其他肝炎病毒在血液透析患者中的感染状况。方法 逆转录－套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）检测血液透析患者血清ＨＧＶ ＲＮＡ,ＥＬＩＳＡ法检测乙肝对半及ＨＣＶ,ＨＤＶ抗体。结果 ８０例血透患者中,ＨＧＶ阳性１５例（１８．７％）,ＨＣＶ阳性１８例（２２．５％）,ＨＢｓＡｇ阳性２１例（２６．２％）,未检出ＨＤＶ阳性。在１５例感染ＨＧＶ的患者中,７例（４６．７％）同时感染其他肝炎     

应用PRPL串联启动子表达HIV-2gag蛋白

探讨ＨＩＶ－２ｇａｇ非融合蛋白的表达。方法：应用ＤＮＡ重组技术,将ＨＩＶｇａｇ基因全序列（ｇａｇ）和部分（ｇａｇ’）ｃＤＮＡ片段克隆到ｐＢＶ２２０载体ＰＲＰＬ串联启动子下游,构建成ＨＩＶ－２ｇａｇ重组表达载体ｐＢＶ－ｇａｇ和ｐＶＢ－ｇａｇ’,在大肠杆菌中表达。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,ＰＢＶ－ｇａｇ’在２１ｋＤ处可见一明显的客外蛋白带,经薄层扫描分析占菌体总蛋白的６．１％,蛋白印迹结果证明,表达