电子显微镜在人体肿瘤诊断中的应用(二)

2251电子显微镜在人体肿瘤诊断中的应用(二)@杭振镳$华西医科大学附一院 @魏于全$华西医科大学附一院~~     

15例肝细胞癌的电镜观察——与早期人胚肝的超微结构对比分析

作者用光镜及电镜观察了１５例肝细胞癌。用电镜观察了５例早期人胚肝作对比，两者在超微结构上有相似之处，这对电镜下判断肝细胞癌，特别是肝外转移的肝细胞癌有重要意义。两者也有较多差别，如癌细胞多形性，异质性，细胞结构成分的不同步分化，以及浸润性生长特点。这给电镜下判断肿瘤的良恶性，提供了重要依据。还观察了多个单个的死亡癌细胞，这些细胞虽未见凋落小体形成，但仍属癌细胞的凋落性死亡。在肝细胞癌半数病例中见到淋巴细胞溶癌现象，并可见较多大颗粒淋巴细胞     

肺癌间质成分的超微结构研究

作者通过对33例肺癌组织间质成分的超微结构观察,发现肺癌细胞对其周围的基板及基质具有破坏作用,同时间质成分对肺癌细胞的浸润也表现出明显的反应性改变,淋巴细胞及巨噬细胞对癌细胞具有杀伤作用;癌细胞周围常见成熟的肌纤维母细胞,早期的肌纤维母细胞、活跃的纤维母细胞及静止的纤维母细胞;肥大细胞常与纤维母细胞及肌纤维母细胞接触。文内,作者还对间质反应的作用及意义进行了讨论。     

恶性骨肿瘤化疗药物敏感性研究

目的：分析恶性骨肿瘤化疗药物敏感性和多药耐药物,为选择敏感的化疗药物,制定个体化疗方案提供依据。方法：取恶性骨肿瘤新鲜标本32例（骨肉瘤20例,其他12例）,运用流式细胞术、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术,检测MTX等化疗药物作用后的恶性骨肿瘤细胞凋亡情况及其多药耐药基因（MDR一蛋白P170的表达,分析其化疗敏感性和耐药性。结果：不同化疗药物作用后的骨肉瘤细胞调亡百分比分别为：MTX30．50±10．22％,ADM26．28±9．35％,MMC23．11±7．38％,VP－1618．17±6．14％,VCR4．44±2．55％,CTX1．22±0．59％。10例骨母细胞型骨肉瘤,IvITX作用后瘤细胞凋亡百分比为12．16－41．52％。P170蛋白表达较高的8例肉骨瘤,对MTX等化疗药物的敏感性均低于P170低表达者。结论：恶性骨肿瘤的化疗敏感性有很大个体差异,流式细胞术分析化疗药物作用后的恶性骨肿瘤细胞调亡,是一种简单、快速、灵敏的化疗药敏检测方法。P170蛋白表达的流式分析,可预测恶性骨肿瘤的耐药性和化疗敏感性。     

水泡口炎病毒基质蛋白对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)基质蛋白(matrix protein, M 蛋白)对鼠CT26结肠癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨其对结肠癌治疗的可行性和意义. 方法 采用脂质体转染技术将已构建的水泡口炎病毒基质蛋白(VSV-M)重组真核表达质粒pcDNA3.1-M 转入CT26细胞,Western blot检测M蛋白体外表达;采用噻唑蓝(MTT)法检测M蛋白质粒对CT26肿瘤细胞增殖的影响;碘化丙锭(PI)染色检测CT26肿瘤细胞凋亡的形态学改变;流式细胞术定量观察104个细胞中亚G1期细胞所占比例.结果 重组质粒转染CT26细胞后,Western blot检测到了M蛋白体外表达;倒置显微镜下观察到细胞形态学的改变;MTT检测到重组质粒转染CT26细胞48 h后生长明显抑制,与对照组相比抑制率达76.4%,差异有统计学意义(P<0.05);PI染色检测到CT26细胞凋亡核改变;流式细胞术检测到M蛋白诱导了CT26细胞的凋亡,凋亡率达80.2%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 VSV-M蛋白真核表达质粒pcDNA3.1-M导入小鼠结肠癌细胞CT26后诱导了细胞凋亡,对结肠癌具有治疗意义.     

体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的 采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原. 方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组.经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒.将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰.最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠. 结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达.重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性.重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞. 结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索.     

流式细胞仪定量软骨肉瘤的P27表达研究

目的：新近发现的新颖细胞周期素依赖激酶抑制剂Ｐ２７在细胞增殖和分化调控中起非常重要作用。本研究目的是探讨流式细胞仪定量Ｐ２７表达在软骨肉瘤中的意义。方法：免疫组化测定软骨肉瘤石蜡切片中Ｐ２７表达，再用流式细胞仪对Ｐ２７表达定量。统计处理用Ｄｕｎｎｅｔｔ－检验和Ｓｐｅａｒｍａｎ秩相关检验。结果：Ｐ２７表达在良、恶性软骨肿瘤间存在极显著差异（ｔ＝５２１，Ｐ＜００１）。Ｐ２７表达与软骨肉瘤分级显著正相关（ｒ＝０９３８，Ｐ＜００５）。软骨肉瘤分级高分化差者，Ｐ２７表达愈高。结论：Ｐ２７蛋白可作为软骨肉瘤诊断标记物和预后指标。     

用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物P170

为研究检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物，采用间接标记法，用鼠抗人Ｐ１７０单克隆抗体，二抗为ＦＩＴＣ标记兔抗鼠Ｉｇ，应用流式细胞仪检测了２９例新鲜实体肿瘤组织和一株多药耐药的Ｋ５６２细胞株。结果显示：１８例肿瘤细胞表达Ｐ１７０，其阳性率为６２．１％，１１例未检出表达，其阴性率为３７．９％；９９．９％Ｋ５６２细胞表达Ｐ１７０。在１８例Ｐ１７０阳性表达的样本中，有１６例阳性表达百分比低于３０％；只有２例高于３０％。提示大多数肿瘤组织细胞表达Ｐ１７０阳性率高，但表达Ｐ１７０肿瘤细胞表达百分比低。检测肿瘤组织的Ｐ１７０表达能为临床治疗提供一个可靠的参考指标。     

重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、纯化及鉴定

目的构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子重组表达载体，进行蛋白质原核表达，并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法首先通过限制性核酸内切酶酶切及连接反应，构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确性后，再转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白质表达。表达产物经Ni—NTA亲合层析及肠激酶特异性酶切进行分离纯化，最后用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定等显示目的基因片段和阅读框架正确无误，表明非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF、构建成功。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达，分离纯化的表达产物xVEGF和mVEGF的纯度达到95％以上，其相对分子质量与预期值一致。抗小鼠VEGF抗体可特异性识别xVEGF和mVEGF。结论重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、分离纯化及鉴定成功，为进一步研究异种VEGF蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础。