HLA分子三维结构与GVHD相关性研究

目的 进一步探索GVHD的发病机制,提高临床移植疗效。方法 HLA分型方法包括血清-细胞学、基因和基因亚型分型。血清-细胞学分型采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验和混合淋巴细胞培养;基因分型采用PCR-SSP方法,对基因亚型进行DNA测序,再进行HLA三维结构模拟。结果 (1)供-受体间HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学相合,组基因相合,基因亚型不同,但HLA三维结构模拟两者差别不明显,骨髓移植后仅发生了Ⅱ度GVHD;(2)供-受体间,基因亚型不同,两者仅差1个氨基酸,供-受体间抗原三维结构差别明显,骨髓移植后发生Ⅳ度GVHD;(3)受体为HLA-A~*0201,供体为A~*6801,二者血清学呈强交叉反应,其它位点均相合,移植后发生Ⅳ度GVHD,后经HLA三维结构模拟,两者差别明显。结论 当异基因骨髓移植供-受体间HLA基因亚型不同时,移植后GVHD的发生程度与HLA分子三维结构差别大小有密切关系;GVHD与抗原氨基酸差别的数量没有直接关系。     

HLA-B27转基因动物研究进展

ＨＬＡ Ｂ2 7是第一个发现与疾病相关的ＨＬＡ等位基因 ,也是到目前为止相关性最高的一个。自 1973年Ｂｒｅｗｅｒｔｏｎ等[1] 和Ｓｃｈｌｏｓｓｔｅｉｎ等[2 ] 提出强直性脊柱炎 (ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ ,ＡＳ)与ＨＬＡ Ｂ2 7抗原有非常强的关联以来 ,人们发现ＨＬＡ Ｂ2 7还与反应性关节炎、银屑病性关节炎、炎症性肠病性关节炎、青少年脊柱关节病、急性前葡萄膜炎等明显相关。随着研究的深入 ,虽然人们提出了许多ＨＬＡ Ｂ2 7与ＡＳ相关的假说 ,如分子模拟假说、关节源性肽假说、Ｂ2 7自身的变异等 ,但是Ｂ2 7在Ａ…     

重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究

目的研究重组人干细胞因子-血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物，利用RT—PCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段，采用基因融合新策略将其融合成SCF-TPO融合基因，克隆到pGEM—T载体中，构建pET32a／SCF-TPO融合基因原核表达载体，在宿主菌E.eoliBL21(DE3)plysS中经异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCF-TPO，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测。目的蛋白经包涵体变性，金属螯合层析纯化，透析复性，用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCF-TPO融合基因的高表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上。Western blot法鉴定表达正确，MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性，浓度为100ng／ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCF-TPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。     

造血干细胞移植中HLA—A、B、C基因分型影响因素的探讨

目的：为提高造血干细胞移植供—受体HLA-I类配型的准确度、特异性和分辨率，对HLA—A、B、C位点基因分型的影响因素进行探讨。方法：分别采用2％EDTA钠盐、钾盐和肝素抗凝血标本，提取200例造血干细胞移植供—受体的外周血DNA，采用美国PEL—FREEZ微量SSP^TM HLA—1类分型试剂盒对该200例标本进行基因分型，并对其影响因素进行分析。结果：2％EDTA钠盐抗凝血标本扩增效果好于2?TA钾盐抗凝和肝素抗凝。DNA浓度范围为25-200ng／μl，最佳浓度为100ng／μ1，A260／A280比例在1．65—1．80之间。溴化己锭(EtBr)浓度为0．2—0．5μg／ml，EtBr量不足将导致无反应带或反应带变弱，EtBr量过多使凝胶本底偏高，影响阳性带的判定。DNA Tag酶的最终反应浓度为0．05U／μl，其活性的高低将直接影响反应结果。结论：确立了HLA——A、B、C位点基出分型PCR—SSP的最佳实验条件，必将提高临床造血干细胞移植供—受体HLA—1类配型的准确度、特异性和分辨率。     

人类白细胞抗原-B27与强直性脊柱炎关联的研究新进展

发现人类白细胞抗原(HLA)-B27与强直性脊柱炎之间的关联已经有30多年的历史，这种关联已经拓展到其他类型的脊柱关节炎(SpA)，并在世界上的许多人种中得到证实。SpA与主要组织相容性复合体(MHC)之问的遗传学联系已经得到确定，类脊柱关节炎也在HLA-B27转基因动物中发生。因此，许多研究认为B27在发病机制上起着直接的作用，但是仅在其他易感性等位基因存在时。尽管对HLA-B27的结构和功能有了详细的了解，但是对它的致病机制仍然不清楚。     

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化

目的：我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL／BL21 pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主，而少部分为可溶形式，本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法：针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果：该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60％；通过大量对比研究，我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL／BL21 pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案：即过夜活化的菌种以2％浓度接种于2YT培养基，22℃培养至D值约为0．4时加入0．1mmol／L IPTG，诱导12h，由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白，目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24％。结论：通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素，获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌，为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。     

特异性表达新霉素耐药基因NeoR的人乳腺癌细胞模型的建立

将含有Ｎｅｏ＾Ｒ基因的ＰＳＶ２－ｎｅｏ质粒经扩增,提取及纯化,以磷酸钙共沉淀法转染入ＭＤＡ人乳腺癌细胞系,经Ｇ４１８长期高压筛选出７株ＭＤＡ细胞克隆,采用Ｎｅｏ＾Ｒ基因特异性引物进聚合酶链反应,证实了Ｎｅｏ＾Ｒ基因在各株Ｇ４１８抗生ＭＤＡ细胞基因组中的整合。     

CD34+造血细胞免疫磁性高效富集仪CMSI-100的研制及应用

根据免疫磁性分离原理,选用能产生高磁场强的磁性材料钕铁硼,其核心是将其设计成由低碳钢间隔的4块钕铁硼,并且使每块钕铁硼的规格必须限制在3.5cm×2.0cm×0.3cm,以确保每块钕铁硼平面所具有的磁场强度平均可达2 700高斯.当所切磨的钕铁硼规格达不到该标准时,由此产生的磁场强度>2 700高斯或<2 700高斯, 对CD34+造血细胞的分离效果均不理想.经对人正常骨髓CD34+造血细胞的免疫磁性分离证实,采用CMSI-100富集后的CD34+造血细胞纯度平均＞90%,细胞活力＞95%,达到国际上最好水平,其性能完全可与国际通用先进的IsolexTM50磁性分离系统相媲美.     

雌激素诱导蛋白pS2表达与ER阳性原发乳腺癌患者辅助内分泌治疗疗效的关系

目的:探讨雌激素诱导蛋白pS2的表达与乳腺癌临床参数和辅助三苯氧胺TAM治疗疗效的关系,明确pS2对辅助内分泌治疗的指导地位。方法:采用免疫组化S蛳P法检测81例ER阳性原发乳腺癌的石蜡切片pS2的表达, 统计学分析其与预后的关系。结果:原发乳腺癌pS2的阳性表达率为66.7 %,其表达与手术年龄(P=0.037)、月经状态(P=0.016)、肿瘤大小(P=0.029)、PR表达情况(P<0.001)密切相关,年龄小于50岁、绝经前、小肿瘤、PR阳性的患者pS2阳性率高。单因素分析和多因素分析均表明pS2是预测OS的独立预后因子。同时pS2对DFS也具有独立预后价值(P=0.023)。结论:pS2是预测ER阳性乳腺癌患者辅助内分泌治疗疗效的独立指标。     

重组人干细胞因子在原核系统中高效表达的策略

目的　探索并建立人干细胞因子 (SCF)的原核高效表达系统。方法　设计特异性引物 ,以RT PCR从人胎肝组织中扩增出干细胞因子的膜外区活性片段 ,克隆进入pGEM T载体。以Goldkey软件进行翻译起始序列RNA结构和自由能优化 ;通过合成寡核苷酸和PCR技术将SCFcDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子 ;酶切连接构建多种原核表达载体并比较它们在宿主菌中诱导表达结果。表达产物经SDS PAGE、WesternBlot和MTT活性鉴定。结果　扩增SCF膜外区序列测定正确。构建的原核表达载体 pET32a(+) SCF在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,表达产量达 30 %以上 ,WesternBlot鉴定正确 ,初步纯化产物的活性与标准品相似。结论　根据使用的载体 /宿主系统 ,翻译起始序列 (TIS)的RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变对表达无影响 ;SCF基因在 5′端融合要比 3′端融合表达效率高