乳腺癌患者骨髓与外周血中的癌细胞研究

在自体骨髓或外周血造血干细胞支持下的大剂量化疗是近来乳癌治疗的一大进展[1]。但是先期采集的自体造血干细胞采集物将逃避大剂量化疗，再回输给病人。因此人们迫切需要了解的是：1．乳癌患者骨髓与外周血中的瘤细胞阳性率有多高？2．自体造血干细胞采集物中存在的乳癌细胞对临床有何意义。骨髓和外周血中乳癌细胞的阳性率对骨髓中存在乳癌细胞的研究可追溯到六、七十年代[2]。近来由于自体骨髓移植在大剂量化疗中的广泛应用，人们对乳癌的骨髓累及进行了深入的研究。从临床积累的大量资料看，乳癌细胞累及骨髓可发生在各期病人。其中Ⅰ期…     

新型重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的：对高效表达的重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法：对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性，经离子交换层析。结果：工程菌HB101／pE01T的表达产物是以包涵体形式存在，菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后，再超声破碎效果最好；包涵体的洗涤则先用Triton-X-100洗2次，再用8mol／L尿素洗涤一次效果更优；最佳变性条件为在7mol／L盐酸胍中加入0．065mmol／L的DTT和0．2mol／L的盐酸精氨酸；最佳复性奈件为在10℃复性保持24h，蛋白浓度保持在30～80μg/ml，并需加入0．2mol／L盐酸精氨酸；利用谷胱甘肽的氧化还原法，当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在2：1时所获得的活性成分得率最高；利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为95％的目的蛋白，所得融合蛋白可与IL-6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL-6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论：本研究获得重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。     

以红细胞生成素为基础的新型红系造血促进剂研究进展

红系造血的主要调节因子是红细胞生成素 (Erythropoi etin ,Epo) ,它可通过与红系造血祖细胞表面的特异性受体结合 ,促进红系祖细胞的存活、增殖、分化和成熟 ,维持和增加循环中的红细胞数量[1] 。慢性肾功能衰竭、肿瘤放化疗、艾滋病和胃肠道炎症所导致贫血需要使用Epo来治疗。基因重组的人Epo体内半衰期短 ,大约为 6h ,需要反复多次给药。因此 ,人们希望发现更稳定、高效、方便的人Epo产品或其类似物 ,这方面的进展主要有高度糖基化Epo Darbepoetin或新的红系造血刺激蛋白 (NESP)、Epo二聚体、GM CSF/Epo、IL 3/Epo、Epo/Tpo(C)…     

IL-6受体α亚单位mRNA和蛋白在人白血病细胞中的表达

为了探讨IL－6R的α亚单位基因与蛋白在人白血病细胞中的表达，为临床利用IL－6／IL－6R系统介导重组IL－6－PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞提供可靠依据，采用RT－PCR半定量技术、直接免疫荧光标记及流式细胞术检测了IL－6R的α亚单位基因及蛋白在多种人白血病细胞细胞系中的表达。结果表明，粒系、单核系、红白血病细胞系HL－60，KG－1，U937和TF－1均高表达IL－6R的α亚单位基因和蛋白；淋巴系白血病细胞系Raji亦有一定量的基因表达；而淋巴系细胞等CEM和HuT28以及慢性粒细胞白血病细胞系K562无论是IL－6Rα亚单位的基因还是蛋白均为阴性。相对表达丰度依次为KG－1＞TF－1＞U266＞U937＞HL－60＞Raji。鉴于粒系、单核系、红白血病细胞高表达IL－6Rα亚单位的基因和蛋白，而IL－6Rα亚单位蛋白在正常人外周血细胞均为阴性表达这一事实，提示可以利用IL－6／IL－6R系统介导重组IL－6－PE40外毒素融合蛋白进行靶向杀伤和治疗这些白血病，而且不会对正常血细胞产生毒副作用。     

重组人干细胞因子双体分子融合蛋白的构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的：设计并构建重组人干细胞因子的双体分子(BiSCF)融合蛋白并在原核中表达，预测该新型BiSCF融合蛋白的分了结构特性。方法：采用分子克隆方法分别构建SCF单体分子与BiSCF的原核表达载体pET32／SCF和pET32／BiSCF，并在大肠杆菌中进行表达，表达产物以Western BLot加以鉴定：采用生物信息学方法，以DS Gene1．1和ProtScale软件对该融合蛋白的结构特征诸如二级结构、等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析。结果：首次成功构建BiSCF双体分子pET32／BiSCF的原核表达载体，并经NcoⅠ和NotⅠ双酶切电泳及测序证实。通过转化origami^TM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得了高效表达，表达产量在40％以上：Western Blot显示表达产物能与抗SCF多克隆抗体特异性结合。对BiSCF双体分子融合蛋白的结构特性预测表明，BiSCF双体分子融合蛋白中的两个SCF单体分子其等电点、抗原性及亲水性均无显著改变，接头处具有高柔性。与SCF的原始序列相比，BiSCF的一级结构中有2个氨基酸发生了改变：二级结构中除插入的接头为无规卷曲外，原来的α螺旋和β片层均无改变。结论：本研究所构建表达的SCF单体和BiSCF双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达，BiSCF双体分子的结构预测符合我们的设计要求。为进一步深入研究新型BiSCF双体分子融合蛋白的生物学特性奠定了基础。     

造血干细胞移植中供—受体配型选择新标准—HLA分子模拟三维结构匹配

为了确定人类白细胞抗原（HLA）三维结构配型的标准,总结出主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因。我们采用分子模拟技术模拟了HLA分子的三维结构。用计算机软件比较模拟结构间的差异大小,结果表明,HLA分子模拟结构间的差异不同,在大量统计分析基础上可以认为,HLA-A和-B分子整体相对均方差（relative mean square deviation,RMSD,单位nm)大于0.04nm为差异显,小于0.02nm为差异不显;DRB1位点间RMSD大于0.02nm为差异显,小于0.01nm为差异不显,据此进一步总结了主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因情况。本研究提示,HLA三维结构配型是移植配型领域的新观点,值得进一步深入研究。     

造血干细胞移植中HLA-II类基因分型影响因素的探讨

目的: 为了准确地进行造血干细胞移植供-受体的HLA - II 类配型,对HLA - II 类基因分型实验的影响因素进行了探讨.方法:采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTM HLA-II类PCR-SSP分型试剂盒对400例造血干细胞移植供-受体进行基因分型.结果:采用0.5 %EDTA抗凝的血标本与肝素抗凝的血标本相比,前者的扩增效果好.DNA终浓度为25～200 ng/μl,最佳浓度为100 ng/μl,A260/A280比例在1.65～1.80之间.PCR反应参数是影响反应的重要因素之一.DNA Taq酶的使用量和活性将直接影响反应结果.D-MIX管应保存在-65℃,避免反复冻融,否则将使反应带变弱.结论:HLA-II类基因分型标本的处理和反应条件的优化是影响基因分型效果的因素.     

新霉素耐药基因（Neo^R）的整合与表达并不改变人乳癌细胞（ …

目的：通过对比ＭＤＡ－Ｎｅｏ＾Ｒ与ＭＤＡ人乳癌细胞的生物学特征,阐明原核标志基因ｅｏ＾Ｒ的长期稳定整合与表达是否对乳癌细胞原有的生物学特性产生影响。方法;对已建立证实表达Ｎｅｏ＾Ｒ基因〉６个月的７株ＭＤＡ－Ｎｅｏ＾Ｒ的细胞系进行Ｇ４１８抗性,表面抗原,细胞倍增时间,细胞周期,肿瘤细胞集落形成及裸鼠体内成瘤能力的检测。     

HLA-B*2705重链的原核表达和活性鉴定

本研究探讨HLA-B*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLA-B*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEM-T载体,序列测定后构建原核融合表达载体pET32a( )-B*2705,并转化大肠杆菌。Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外是否具有HLA-B27抗原活性。结果表明:HLA-B*2705重链融合蛋白在大肠杆菌中获得高效融合表达,表达产量占细菌总蛋白的50%以上;通过Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外具有HLA-B27抗原活性。结论:本研究获得了HLA-B*2705重链融合蛋白,为今后的相关研究打下了基础。