实时定量PCR方法监测重组痘苗外源基因传代稳定性

目的 建立实时定量PCR方法 以监测外源基因在不同重组痘苗代次中的稳定性.方法 裂解法提取8个代次插入有HIV基因的重组痘苗DNA,用实时定量PCR的绝对和相对定量方法 ,研究不同代次基因组中插入的外源基因与痘苗基因组的数量关系.结果 绝对和相对定量方法 均证明,在传代过程中,重组痘苗中的外源基因有缺失现象.结论 建立的实时定量PCR方法 可以特异、定量地分析外源基因在重组痘苗中的稳定性.     

酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白的免疫原性研究

目的评价毕赤酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在Balb／c小鼠诱导体液和细胞免疫的能力。方法利用重组Gag蛋白单独及与重组DNA或痘苗联合免疫Balb／c小鼠，检测小鼠产生的特异性结合抗体和IgG1／IgG2a，同时检测T淋巴细胞增殖反应和CTL反应。结果3个蛋白单独免疫组均能诱导小鼠产生抗体和T淋巴细胞增殖反应，其中不加佐剂的免疫组诱导免疫反应低于其它两组。但3组的CTL杀伤活性均不明显。重组蛋白和重组DNA及痘苗联合免疫均诱导产生了较好的体液和细胞免疫反应，而且重组痘苗初始免疫一蛋白加强免疫组还诱导产生了较强的CrL反应。结论酵母表达的HIV-1 Gag蛋白具有良好的免疫原性，在与重组DNA和痘苗疫苗联合使用时具有协同作用，能刺激动物产生更强的HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。本研究为构建HIV-1蛋白疫苗和探讨各类疫苗的联合免疫方式提供了有价值的参考数据。     

HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在毕赤酵母中的表达纯化和鉴定

目的　利用毕赤酵母表达系统高效表达HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,初步确立发酵和纯化工艺。方法　PCR扩增CN5 4Gag基因,插入毕赤酵母表达载体pPS1 0 ,电转化毕赤酵母菌株GS115 ,G4 18筛选高表达工程菌,利用5L发酵罐进行高密发酵,通过SPSepharoseFF和DEAESeparoseFF柱层析,用HIV 1阳性血清和p2 4抗原检测试剂盒对纯化后的Gag蛋白进行免疫学性质的鉴定。结果　构建了高效表达CN5 4Gag蛋白的毕赤酵母工程菌株,发酵罐培养的菌体密度吸光度(A6 0 0 值)超过30 0 ,Gag蛋白表达量达到12 0mg L。纯化后的Gag蛋白纯度高于90 % ,p2 4检测强阳性并能够与HIV 1阳性血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论　本研究在毕赤酵母中高效表达了HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,并进行了纯化和鉴定,为针对我国新一代HIV蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

人免疫缺陷病毒1型CRF07_BC毒株准种间的重组

目的 通过研究人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus1，HIV-1）感染者个体内准种间的差异，探讨HIV的系统进化的发生模式。方法 从HIV-1感染者血浆中提取总RNA，通过逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）获得HIV．1gp120全长基因，纯化后装入T载体，转化至TOP10大肠埃希菌内增殖，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，对所获得的目的克隆测序并分析。结果 获得同一患者的16个克隆的gp120全长基因序列，通过系统进化树分析，克隆序列均为CRF07_BC亚型，但在系统进化树上16个克隆可明显分为A、B两群，其中13个克隆属于A群，2个克隆属于B群，1个克隆（编号XPD7）位于A、B群之间，通过simplot软件的重组分析，发现XPD7克隆为A群和B群的重组株。结论 发现了我国广泛流行的HIV-1CRF07-BC毒株准种间的重组现象，准种间的重组作为HIV进化的一种有效手段将导致HIV毒株的快速进化的发生，可能更易逃脱宿主的免疫监控。     

使用多重巢式PCR对我国HIV-1主要流行株亚型鉴定方法的建立

目的 建立一套新的亚型鉴定方法，仅仅使用巢式PCR，一次扩增，即可对我国HIV-1主要流行株B、C和CRF01-AE进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸，使用能覆盖HIV-1型M组gag区的引物进行第一轮扩增，第二轮扩增则使用分别检测B、C、CRF01-AE亚型的三套特异性引物进行扩增，三套引物放在同一个反应管中。反应产物经琼脂糖电泳后观察，不同亚型的位置不同，以此来判断亚型。另外设计一套引物，专门检测我国重组株CRF07-BC和CRF08-BC。所有样品均经过基因测序、系统进化树分析，以进行结果验证。结果 在检测的119份样品中，经基因测序和系统进化树分析证实B亚型样品43份(欧美B11份，泰国B32份)，C、CRF01-AE、A和D亚型样品分别为54份、17份、3份和2份。其中C亚型的样品，有52份属于CRF07-BC和CRF08-BC。而经过上述多重巢式PCR方法检测到的B亚型样品为35份(81．4％)，C亚型46份(85．2％)和CRF01-AE13份(76．5％)。另外，检测CRF07-BC和CRF08-BC重组株的引物特异性地检测到43份(82．7％)样品。上述结果与基因分析结果吻合，各个亚型之间无交叉，一种亚型的特异性引物只对该亚型有反应，而对其他亚型无反应，特异性达到100％。虽然有时会有非特异扩增带，但一般不影响结果判断。结论 我们建立了一套简单快速的H1V-1亚型鉴定方法，不需基因测序，即可检测我国主要流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC。该方法具有高度特异性和敏感性，可以作为初筛方法在我国及其他国家HIV-1实验室推广使用。     

我国HIV-1主要流行株外膜蛋白(env)基因V3～V4区变异及其与生物学特性的关系

目的　研究我国HIV 1主要流行毒株亚型的envV3～V4区变异与生物学特性的关系。方法　应用nested PCR对 1 57份获自我国 1 2个省份的HIV 1毒株env区序列进行扩增 ,并使用ABI 377型测序仪测序 ,然后应用BLAST、GCG和MEGA等生物学软件或程序对env基因V3～V4区序列进行分析。结果　B′亚型毒株V3顶端四肽存在着 4种类型 :GPGR ( 54% )、GPGQ ( 2 8% )、GPGK( 1 6 % )和GPGA( 2 % ) ,B′/C重组毒株全部为GPGQ( 1 0 0 % ) ,CRF0 1 AE重组毒株呈现GPGQ( 95% )和GPGR( 5% )两种类型 ;B′/C和CRF0 1 AE重组毒株V3～V4区及其临近区域N 糖基化位点比B′亚型毒株N 糖基化位点保守。而B′亚型毒株V3环的净电荷分别显著高于B′/C和CRF0 1 AE毒株 (P <0 .0 1 ) ;根据V3环关键氨基酸推测辅助受体使用情况的结果显示 :B′亚型毒株有 9.2 6 %可能使用CCR5,7.4 1 %可能使用CXCR4 ,其余 83.33%不能对辅助受体的使用作出预测。所有B′/C重组毒株被预测可能使用CCR5。CRF0 1 AE重组毒株有 90 .4 8%被预测可能使用CCR5,没有被预测为使用CXCR4的序列 ,9.52 %不能作出预测。结论　B′亚型毒株大部分可能为NSI型 ,少部分可能为SI型 ,而B′/C和CRF0 1 AE重组毒株绝大部分为NSI型。我国主要流行株的V3～V4区尤其是V3环的氨基酸     

中国HIV-1主要流行重组株B/C Tat基因第一外显子序列特征分析

目的 研究我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)流行重组株B/C Tat基因第一外显子变异特点,探讨这些变化对其功能的影响.方法 从确诊的HIV-1感染者全血样本中提取基因组DNA,经套式聚合酶链反应(PCR)扩增和测序.使用GCG和Bioedit软件中的程序进行系统进化树和氨基酸变异分析,同时进行网上三级结构预测.结果 总计154份样品中CRF07-BC为120份,CRF08-BC为34份,两种亚型有较广泛的分布,CRF07-BC与标准株的平均基因离散率为(5.748±1.352),CRF08-BC与标准株的平均基因离散率为(1.259±1.931).结论 我国流行重组株CRF07-BC比CRF08-BC有较长的流行时间,CRF07-BC与CRF08-BC基因第一外显子氨基酸相比,主要为半胱氨酸富含区和核心区的变化.在这两个区位点变化可能影响Tat与细胞因子如cyclin T1的结合能力,而成为CRF07-BC在我国流行中获得传播优势的原因.     

HIV-1 LTR区转录功能研究进展

作为获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原体,HIV-1基因组结构复杂,编码大量调节蛋白与辅助蛋白.转录水平调节主要依赖细胞内前病毒长末端重复序列(1ong terminalrepeats,LTR)和病毒因子及大量细胞转录因子的相互作用实现.本文就HIV-1 LTR区的转录调节功能的研究进展作一综述.     

广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型的关系

目的研究广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型间的关系。方法从广西主要流行区收集来的50份HIV-1感染者血液样本中提取前病毒DNA，使用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）扩增HIV-1 env基因片段并进行亚型鉴定，选择38份CRF01-AE重组型HIV-1毒株env，基因V3环及邻近区域的序列进行系统树和氨基酸变异分析。结果38份CBF01-AE重组毒株中36份与分离于广西地区的CRF01-AE.97CNGX2f和泰国代表毒株THCM240接近，另外2份与中非共和国代表株90CF402聚成一簇；CRF01-AE重组毒株V3环顶端四肽存在着4种类型：CPCQ、GPGR、GPGH和GPGA；根据V3环关键氨基酸推测辅助受体使用情况，结果显示：71．05％的CRF01-AE重组毒株可能使用CCR5作为辅助受体，28．95％不能对其辅助受体的使用情况做出预测。结论广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株V3顶端四肽变异较大，而且大部分毒株可能为NSI型。这可为广西该毒株的防治和诊断试剂的更新提供参考。     

医源性HIV感染者CD8+细胞非细胞毒性HIV抑制作用的研究

目的 观察医源性HIV感染者CD8+细胞非细胞毒性HIV抑制反应(CNAR),并比较CNAR与CD4细胞计数的关系.方法 免疫磁珠法分离HIV感染者的CD8+细胞,按2:1,1:1,0.5:1和0.25:1的比例,与体外急性感染的CD4+细胞混合培养,测定培养物上清中逆转录酶活性,与阴性对照比较计算病毒抑制率.结果 CNAR活性达到80%病毒抑制率时,CD4<300个/μl组的平均CD8与CD4比例为2.4:1,CD4>300个/μl组的平均CD8与CD4比例为1.3:1,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 HIV感染者的CNAR活性与其CIM细胞计数相关,CD4>300的个体较CD4<300的个体有着更显著的抑制HIV复制的能力.