人可溶性APO2L/TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的利用基因工程技术原核表达人可溶性APO2L并复性纯化成具生物活性形式。方法用PCR方法扩增APO2LcDNA(密码子114～281)并克隆至表达载体,重组体转化大肠杆菌JF1125摇瓶发酵,筛选高表达克隆于发酵罐经温度诱导表达。经盐酸胍溶解,空气氧化法稀释复性,超滤,Q-SepharoseFF阴离子交换柱层析等方法纯化人可溶性APO2L。利用流式细胞术检测产物对细胞的诱导凋亡活性。结果表达产物约占菌体总蛋白质的20%并在菌体内形成了包涵体,SDS-     

血管生成抑制因子k4k5对实验性脉络膜新生血管的抑制作用

目的 评价血管生成抑制因子kringle4-5能否抑制氩激光诱导小鼠的脉络膜新生血管。 方法 通过氩 激光眼底光凝诱导C57BL/6J小鼠产生脉络膜新生血管，随机分为对照组、低剂量组和高剂量组，每组各16只小鼠。在眼底氩激光光凝后立即对3组小鼠分别球后注射林格氏液、kringle4-5 20、50 μg。在光凝后7、14 d通过荧光素眼底血管造影(fundus fluorescence angiography,FFA)评价脉络膜新生血管的发生率。光凝后14 d将动物处死，行组织学检查及观察CD105的表达。用免疫组织化学方法检测光凝后14 d各组血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达。 结果 对照组，光凝后14 d脉络膜新生血管的发生率为64.3%，低剂量组和高剂量组脉络膜新生血管的发生率分别为51.2%（P＜0.05）、44.1%（P＜0.01）。组织学检查显示治疗组脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)范围小于对照组，与剂量呈正相关，高剂量组差异有显著性的意义(P＜0.05) ,而且CD105的表达，治疗组少于对照组(P＜0.05)。VEGF及bFGF的表达在对照组与治疗组之间差异无显著性的意义。 结论 Kringle4-5对激光诱导小鼠的实验性CNV具有抑制作用，在此剂量范围，对VEGF及bFGF的表达无明显影响。（中华眼底病杂志，2003，19：201-268）     

酵母系统表达的重组人亲肝素性促轴突生长因子及其活性的测定

目的：研究酵母系统表达人亲肝素性促轴突生长因子（heparin-binding neurite-promoting factor,HNBF)的活性,并观察其对体外培养细胞的促轴突生长作用。方法：从18周流产的人胎脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）获得HNBF的编码基因,扩增后与表达载体pPIC9K重组,鉴定筛选得到含HBNF cDNA基因的阳性克隆。用此重组表达载体通过电穿孔法转化毕赤酵母菌株GS115,在不含组氨酸的选择性含糖基础培养基（MD）平板上筛选His 表型,利用G418抗药性筛选多拷贝酵母菌重组子,PCR鉴定含有HNBF cDNA基因与酵母染色体基因组整合的菌株。阳性克隆经甲醇诱导后获得重组人HBNF（hrHNBF)在培养液中的分泌表达。将层析纯化的表达产物加入体外培养的大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞株,观察其促轴突生长作用。结果：目的基因序列与基因库资料完全一致,目的基因在该载体中位于α因子分泌信号序列的下游,与α因子开放阅读框相连。SDS－PGAE蛋白电泳证实诱导表达的产物相对分子质量约为18000,它对培养的PC12细胞株具有促轴突生长作用。结论：通过毕赤酵母菌可以稳定地表达hrHNBF,而且表达产物hrHNBF具有促进神经轴突生长的生物学活性。