幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）临床儿童分离株尿素酶B（UreB）基因入Pgex-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法：根据GenBank中Hp UreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoR I及Not I酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果：以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1 710 bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1 UreB序列已登录GenBank（登录号：FJ455126）。结论：从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreB Hp口服疫苗研制奠定了基础。［中国当代儿科杂志,2009,11（11）：877-880］     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ldh-1基因的序列分析及原核表达

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株携带的ldh-1基因进行克隆、表达,为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)功能研究奠定基础。方法根据金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因序列,设计一对特异性引物,以MRSA临床分离株(菌株号:1758)DNA为模板PCR扩增ldh-1,纯化DNA进行BamH I、Xhol I双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。诱导表达后的重组菌经超声破碎离心后,使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果成功构建重组表达质粒pET-28a-ldh1,基因测序结果显示,扩增的ldh1基因全长956 bp,与金黄色葡萄球菌Mu50株ldh1基因的序列同源性为100%。IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳在39×103Mr处见目的条带,Western blot验证了重组蛋白L-LDH的表达。该蛋白呈可溶性表达,纯化后获得0.5 g/L的重组蛋白。结论在MRSA(菌株号:1758)临床分离株中成功克隆及表达了ldh-1基因,获得了纯化的重组蛋白,为进一步进行L-LDH的功能研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因,即腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因,所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白作鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783bp,始于ATG,止于TAG,预测的等电点和相对分子质量分别为7.75和29×103,目的基因与Genbank腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55×103见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因。     

广州地区脑血管病病人感染产超广谱β-内酰胺酶菌耐药性调查

目的了解广州地区脑血管病病人感染产超广谱β-内酰胺酶革兰阴性杆菌情况及对18种抗生素耐药性进行调查分析.方法对广州12家医院分离的3 499株革兰阴性杆菌,其中包括分离自神经内科、神经外科脑血管病病人389株,检测其超广谱β-内酰胺酶,并以K-B法检测所有菌对18种抗生素的敏感性.结果广州地区常见革兰阴性杆菌产超广谱β-内酰胺酶总体检出率38.4%(819/2134);神经科脑血管病病人超广谱β-内酰胺酶检出率5 5.5%(121/218);其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的检出率分别是53.1%、57.5%.结论广州地区脑血管病病人大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶检出率与总体检出率比较有统计学意义(P＜0.01),18种抗生素的耐药率所有产酶株与非产酶株比较有统计学意义.     

广州地区儿童急性呼吸道感染流感嗜血杆菌耐药性和血清分型研究

目的　了解2000—2007年广州地区急性呼吸道感染儿童流感嗜血杆菌（Hi）耐药性和2000—2003年分离的Hi血清分型情况，有效指导临床合理用药。方法　采集2000年1月至2007年12月广州市儿童医院门诊及住院的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物或深部吸痰标本，应用Hi选择培养基进行分离培养；用E-test法检测Hi对阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头胞曲松、氨苄西林、头胞克洛的耐药性，用K-B法检测Hi对阿奇霉素、四环素、氯霉素、复方新诺明的耐药性；采用头孢硝基噻酚显色反应法检测β-内酰胺酶。用玻片凝集法对2000—2003年分离的381株Hi进行血清分型。结果　在8年时间内，Hi对阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头胞曲松、阿奇霉素敏感性较高，对氨苄西林、头胞克洛、氯霉素、四环素的耐药率呈逐年上升趋势，复方新诺明的耐药率高达72.13%；氨苄西林耐药的Hi多重耐药率达82.51％。Hi的产酶率也由2000年的9.91％上升到2007年的36.48％。2000—2003年所分离381株Hi的血清分型以不定型株为主，占95.53％，Hib仅占1.57％。结论　广州地区急性呼吸道感染儿童流感嗜血杆菌血清分型以不定型株为主，Hib分离率不高；广州地区急性呼吸道感染儿童Hi的耐药性和产酶率有逐年上升趋势；治疗Hi感染以β-内酰胺类抗菌药物为首选。     

儿童肠道感染致病性大肠埃希菌血清型分布及耐药性研究

目的:了解广州地区儿童细菌感染性腹泻粪便中检出致病性大肠埃希菌(EPEC)的血清型分布及耐药特征,为本地区的流行病学研究及临床合理用药提供依据,方法:采集2007年7月至2009年6月来我院就诊的腹泻患儿大便标本进行常规病原菌的分离培养,时可疑菌株进行生化鉴定和血清学分型,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验.结果:4 568例大便标本共检出EPEC 113株,检出率2.47%.血清学分型共检测到10种血清型,主要以055K59、O126K71、O44K74为主,分别占15.93%、15.04%、15.04%.EPEC对氨苄西林耐药率较高,已达85.8%,对复方新诺明、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶的耐药率分别为69.0%、37.2%、37.2%、15.9%,但对舒普深敏感率仍高达96.5%.结论:广州地区腹泻儿童肠道感染的EPEC血清分型较为分散,以O55K59、O126K71和O44K74为主.EPEC对氨苄西林的耐药率已较高,舒普深可作为临床EPEC感染治疗的经验用药.     

鼠伯氏疟原虫CSP基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。     

广州地区肺炎住院患儿感染肺炎链球菌的血清型分布及耐药性研究

目的了解广州地区肺炎住院的患儿感染肺炎链球菌的耐药性及血清型分布情况。方法用吸痰法采集患儿痰标本进行涂片，革兰氏染色镜检，合格痰标本划线接种血平板，用E-test法检测分离到的肺炎链球菌对青霉素、阿莫西林、头孢曲松、头孢呋辛、亚胺培南、氧氟沙星、万古霉素、红霉素和克林霉素9种药物的耐药性，采用K-B法检测四环素、复方新诺明的耐药性，并采用荚膜肿胀技术对分离到的79株肺炎链球菌进行血清分型。结果79株肺炎链球菌中青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）11．4％，青霉素中介肺炎链球菌（PISP）77．2％，青霉素敏感肺炎链球菌（PSSP）11．4％，对红霉素、克林霉素的耐药率分别为100％和93．7％，对阿莫西林、氧氟沙星、万古霉素的耐药率均为0，对头孢曲松、头孢呋辛、亚胺培南的耐药率分别为3．8％、72．2％、2．5％。79株肺炎链球菌中只有1株PSSP仅对红霉素耐药．78株肺炎链球菌对两种以上药物耐药．多重耐药率为98．7％（78／79），同时对克林霉素、红霉素、四环素、复方新诺明耐药的菌株65株，占82．3％（65／79）。79株肺炎链球菌血清型分别为19F（70．9％），23F（16．5％），6B（5．1％），4（2．5％），15B（2．5％），不能分型（2．5％），7价疫苗涵盖率为94．9％（75／79）。结论广州地区肺炎住院患儿肺炎链球菌对大环内脂类抗生素红霉素和林可酰胺类抗生素克林霉素耐药情况严重，对二代头孢菌素头孢呋辛耐药率居高，临床治疗儿童肺炎链球菌感染的肺炎应首选阿莫西林和三代头孢菌素。7价疫苗覆盖率高。预防儿童肺炎链球菌感染所致的肺炎，采用7价疫苗可以达到很好效果。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CHIPS基因的克隆、序列分析及原核表达

目的 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)趋化抑制蛋白(CHIPS)进行扩增、克隆、序列分析、原核表达及纯化,为后续的疫苗研究奠定基础.方法 根据GenBank中趋化抑制蛋白(CHIPS)的序列,设计一对特异性引物,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增CHIPS基因,纯化DNA进行EcoRI、XhoI双酶切鉴定及测序鉴定,并将CHIPS亚克隆入表达载体PET-28α,转化感受态大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导表达重组蛋白,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证重组蛋白的表达.结果 以金黄色葡萄球菌临床儿童分离株基因组为模板,成功扩增CHIPS基因,基因大小为450bp;重组PET-28a(+)-CHIPS双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示CHIPS在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.98％.经IPTG诱导后,pET-28a(+)-CHIPS/BL21在相应分子量(17kDa)可见融合蛋白在上清表达,免疫印迹检测到目的蛋白.结论 成功从儿童分离株MRSA中构建了CHIPS的原核表达系统,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为后续的疫苗研究奠定基础.