间充质干细胞治疗激素耐药重度急性移植物抗宿主病

目的:探讨体外扩增骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)治疗激素耐药重度急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease, aGVHD)的临床疗效和安全性.方法:4例恶性血液病患者经HLA匹配同胞外周血干细胞联合骨髓移植后,诊断为激素耐药重度aGVHD,在原有免疫抑制治疗的基础上给予MSCs 0.5 × 106/kg受者体重.结果:4例患者经静脉输注体外扩增MSCs共9例次,未发现输注相关不良反应.所有患者均显示不同程度的治疗反应,总有效率达100%.4例发生消化道aGVHD,完全缓解2例,显著缓解1例,部分缓解1例.2例合并肝脏aGVHD患者中1例获完全缓解,1例获部分缓解.初始显效和充分显效的中位时间分别为3 d(2 ～ 5 d)和23 d(10 ～ 72 d).MSCs输注后,病情缓解者外周血CD8+CD28- T细胞比例明显上升,而CD8+CD28+ T细胞比例下降.结论:MSCs可快速缓解激素耐药重度aGVHD病情,其可能通过对CD8+CD28-/CD8+CD28+ T细胞比例的调控发挥抗aGVHD的作用.     

人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的体外调控

背景:目前肝纤维化尚没有公认的特效疗法,近年来骨髓间质干细胞应用于肝纤维化的治疗已取得一定效果,但具体机制仍不明确.目的:体外探讨人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的调控作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学第三附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青年健康志愿者髂骨,入肝星状细胞购自中山大学实验动物中心,人正常肝细胞系L-02购自中山大学实验动物中心.方法:将分离提纯的人骨髓间质干细胞与肝星状细胞在β孔Transwell板上建立上下共培养体系.接种密度均为2×104cells/well.另设L-02代替人骨髓间质干细胞作为阴性对照,单纯培养的肝星状细胞为空白对照,培养72 h.主要观察指标:肝星状细胞形态及免疫细胞化学染色结果,流式细胞仪检测肝星状细胞凋亡情况,Western blot法检测肝星状细胞活化标志α-肌动蛋白的表达.结果:倒置显微镜下活化的肝星状细胞呈扁平状,胞浆内缺乏脂肪滴,α-肌动蛋白位于肝星状细胞胞质内,呈高张力纤维状分布.与L-02+肝星状细胞组、单纯肝星状细胞组比较,骨髓间质干细胞+肝星状细胞共培养组的肝星状细胞凋亡率明显升高(P<0.05),α-肌动蛋白表达水平明显下调.结论:人骨髓间质干细胞可抑制肝星状细胞活化,促进其凋亡,这可能是骨髓间质干细胞抗肝纤维化的作用机制.     

丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]丹参注射液体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.[方法]采用Ficoll-Paque液离心分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,分别采用含丹参注射液或硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达.[结果]成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×106,15代可获得(2～3)×1012个细胞,细胞流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性.加入丹参或硫代甘油诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性.[结论]丹参可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞.     

同种移植大鼠心脏Ⅱ类主要组织相容性抗原表达及其机制探讨

目的　探讨同种移植心脏术后Ⅱ类主要组织相容性 (MHC)抗原表达及其影响机制。方法　建立大鼠颈部心脏移植模型 ,以同基因移植和无移植动物作为对照 ,采用免疫组化、逆转录PCR等技术测定异基因大鼠移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达和心肌IL 2、IL 4mRNA的水平变化。结果移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达与心肌急性免疫排斥病理学改变明显相关 (P <0 0 1 ) ,排斥早期其阳性表达细胞位于小血管内皮及周围 ,随着急性免疫排斥病变发展心肌IL 2、IL 4mRNA水平与Ⅱ类MHC抗原表达存在相关变化 (P <0 0 1 )。结论　移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达是术后急性免疫排斥识别和效应时相的重要环节 ,急性免疫排斥早期移植心脏功能改变可能与微血管内皮损伤有关 ,受体细胞因子网络对供体Ⅱ类MHC抗原表达有调节作用     

大鼠骨髓间质干细胞体内诱导肝星状细胞的凋亡****☆

背景：骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的疗效已得到很多实验的证实,但其机制仍不明确。 目的：实验观察骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞的凋亡情况,初步探讨骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的机制。 方法：连续8周皮下注射CCl4诱导大鼠肝纤维化。造模成功后,20只大鼠随机分为实验组及对照组,每组10只。实验组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞,对照组经尾静脉注射DMEM培养液。于移植前,移植后第3,7天分别处死大鼠,取其肝脏行羟脯氨酸的检测,苏木精-伊红染色及masson染色,免疫组织化学检测α-SMA及α-SMA+TUNEL双染反映肝星状细胞活化及其凋亡情况。 结果与结论：造模8周后,大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显升高,病理呈进展性肝纤维化表现。移植7 d后,实验组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低,肝纤维化有所缓解,而对照组的肝纤维化程度继续加重。免疫组织化学显示,CCl4注射8周后,α-SMA阳性细胞大量增生,移植后第7天,实验组α-SMA阳性细胞明显少于对照组(P < 0.05)。移植后第3天,实验组肝星状细胞凋亡明显较对照组增加(P < 0.05)。结果提示,骨髓间质干细胞移植有治疗肝纤维化的作用。骨髓间质干细胞诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的主要机制之一。     

以海藻酸三维支架构建骨髓间充质干细胞源性生物人工肝组织的实验研究

目的 以骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)为种子细胞,以海藻酸三维支架为载体,研究两者的相容性及其构建生物人工肝组织的可能性.方法 将大鼠BMSC接种于海藻酸三维支架上,采用倒置相差显微镜、扫描电镜分别检测BMSC的黏附、生长与增殖情况,评价两者的相容性;同时以表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维生长因子4(FGF-4)等细胞因子混合液诱导BMSC向肝细胞分化,检测培养液内尿素氮和白蛋白含量,RT-PCR检测培养细胞ALB和AFP基因的表达,糖原染色及免疫荧光法检测细胞糖原合成功能和CK-18的表达. 结果大鼠BMSC在海藻酸三维支架上能正常地黏附、生长和增殖;于海藻酸三维支架内加入诱导液作用于BMSC后,培养液内尿素和ALB的含量逐渐上升,RT-PCR检测到培养细胞有AFP和ALB基因的表达,同时被诱导的细胞具有糖原储存的功能并表达CK-18.结论 海藻酸三维支架与大鼠BMSC具有良好的相容性;以EGF、HGF、FGF-4等细胞因子混合液为诱导因子,能在海藻酸三维支架上成功诱导BMSC向肝细胞分化;海藻酸三维支架和BMSC可望成为肝脏组织工程理想的种子细胞和细胞载体.     

党参对间充质干细胞增殖影响

目的 探讨党参(Dangshen,DS)对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响.方法 水煮醇沉法制备党参溶液,Ficoll-Paque细胞分离液(1.077×10g/L)分离成人MSCs,体外扩增,将P5～P10代细胞分为DS组和对照组,3d后相差显微镜观察细胞形态,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)微量酶反应法检测细胞代谢活性,流式细胞仪检测细胞周期和免疫表型.结果 DS组细胞代谢活性(0.535±0.041),(0.972±0.129)与对照组(0.440±0.066),(0.82±20.097)相比,差异有统计学意义(P<0.05).DS组S期细胞百分含量(2.14±0.25)%较对照组(1.10±0.04)%增多,凋亡细胞百分含量(1.04±0.62)%较对照组(3.45±1.33)%减少,差异有统计学意义(P<0.05).DS组细胞CD105和CD166表达阳性,CD34和CD45表达阴性,未观察到形态学改变.结论 DS能够促进MSCs的增殖,并且使MSCs仍保持高度的未分化状态.     

CCKB／胃泌素受体及其信号转导系统

ＣＣＫＢ／胃泌素受体是一类在中枢及外周组织广泛分布的脑肠肽受体，其介导的功能多种多样。通过对其分布，结构与功能，当色体定位及信号转导机制的深入研究，将有助于我们发现与其相关疾病的发病机制，并这些疾病的治疗提供依据。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间质干细胞诱导分化为心肌细胞的影响

[目的]探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用.[方法]取大鼠股骨骨髓,采用直接贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞;取P3代骨髓间质干细胞,分别以5-氮胞苷、5-氮胞苷联合bFGF诱导.30 d后用免疫组化法检测细胞的心肌肌钙蛋白,RT-PCR法检测心肌细胞转录因子GATA-4、结蛋白(desmin),并用倒置显微镜在镜下观察细胞的跳动情况.[结果]大鼠骨髓间质干细胞经5-氮胞苷或5-氮胞苷 bFGF诱导30 d后,均呈现心肌肌钙蛋白表达阳性和GATA-4、desmin表达阳性.镜下观察单用5-氮胞苷诱导组未见细胞跳动;联合bFGF诱导组则可见所诱导的细胞呈心肌细胞样跳动.[结论]骨髓间质干细胞在体外能被5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞,但单用5-氮胞苷诱导比不上联用bFGF诱导的效果好.bFGF在体外有促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用.     

大鼠大脑皮质胆囊收缩素受体的体外结合分析法研究

用Ｂｏｌｔｏｎ－Ｈｕｎｔｅｒ试剂联结法标记胆囊收缩素（ＣＣＫ８）,得＾１２５Ｉ－ＢＨ－ＣＣＫ８,其比放射性为３．４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ,放射化学纯度大于９６％,取其与自制的大鼠大脑皮质细胞膜进行受体放射分析,发现标记配体与大鼠大脑皮质ＣＣＫ受体的结合具有温度和时间依赖性,可饱和性,可逆性及特异性,经Ｓｃａｔｃｈｒａｄ分析获大鼠大脑皮质细胞膜ＣＣＫ受体Ｋｄ值为１．０９８ｎｍｏｌ／Ｌ,Ｂｍａｘ为１９７．５