梅毒螺旋体黏附素Tp0751 核酸菌影的构建及免疫原性研究

目的:构建梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751 的重组真核大肠埃希菌菌影(EBG)并检测其在免疫鼠中的免疫原性,为探讨新型梅毒疫苗奠定基础。方法:构建pcDNA3.1(+) / Tp0751 真核表达载体,将其装载入已构建的空EBG 中,形成重组核酸菌影pcD/ Tp0751-BG,计算装载率;将核酸菌影转染鼠源性巨噬细胞RAW264.7,Western blot(WB)鉴定目的蛋白表达。将雌性BALB/ c 鼠随机分为A(PBS)、B(空EBG)、C(空pcDNA3.1)三个对照组和D(pcD/ Tp0751)、E(pcD/ Tp0751-BG)、F(pcD/ Tp0751-BG+rTp0751)三个实验组,各组间隔两周肌注免疫共三次,检测特异性血清IgG 及生殖道黏膜SIgA、小鼠脾细胞增殖水平和分泌IFN-γ水平。结果:重组真核质粒对菌影的装载率为76.1%;WB 显示此转染细胞能有效表达重组目的蛋白。D、E、F 实验组小鼠特异性血清IgG 与生殖道SIgA 效价均随免疫次数增加而增加,各时间点均显著高于三个对照组(P<0.01),于末次加免后第8 周达到峰值,此时F 组IgG 与SIgA 效价分别为1 :102 400 与1 :12 800;首次加免2 周后,E、F 组均显著高于D 组(P<0.01);末次加免2 周后,F 组显著高于E 组(P<0.01)。末次加免后第8 周,D、E、F 组的刺激指数(SI)值与IFN-γ水平均分别显著高于三个对照组(P<0.01);E、F 组均分别显著高于D 组(P<0.01);F 组分别均高于E 组(P<0.05)。结论:Tp0751 真核质粒菌影具有良好的免疫原性,在小鼠体内诱生了有效的系统和黏膜的体液应答以及系统细胞免疫应答;异源加免较同源加免免疫效果更好。     

肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖经EGFR途径诱导支气管上皮细胞分泌细胞因子

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)在肺炎克雷伯杆菌(KP)荚膜多糖(CPS)诱导人正常支气管上皮BEAS-2B细胞分泌炎性细胞因子中的作用。方法:体外培养KP并提取CPS,用不同浓度的CPS刺激BEAS-2B细胞,通过ELISA检测细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)的水平,并于刺激后不同时点通过Western blot检测EGFR的磷酸化水平;EGFR抑制剂AG1478预处理BEAS-2B细胞后,Western blot检测ERK磷酸化水平,间接免疫荧光染色检测p65的核转位,并观察细胞上清中TNF-α和IL-8的变化情况;最后经ERK抑制剂PD98059和NF-κB抑制剂PDTC分别预处理后用CPS刺激细胞,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-8的水平。结果:10 mg/L CPS刺激BEAS-2B细胞12 h能够显著诱导其分泌TNF-α和IL-8;Western blot和间接免疫荧光染色检测结果显示,CPS刺激可显著诱导BEAS-2B细胞中EGFR和ERK的磷酸化及p65的核转位。经EGFR抑制剂AG1478预处理细胞后,ERK的磷酸化水平显著降低,NF-κB的核转位减少;而在EGFR、ERK及NF-κB抑制剂预处理的细胞的上清中,TNF-α和IL-8分泌水平均明显降低(P<0.05)。结论:肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖能够通过EGFR激活ERK和NF-κB信号通路,进而诱导人正常支气管上皮细胞分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-8,提示EGFR可能是KP感染引起炎症反应的关键因子。     

肺炎克雷伯菌FimA的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌毛FimA蛋白并制备多克隆抗体。方法在Clustal Omega网站上比对不同细菌FimA蛋白的同源性。设计特异引物,PCR扩增肺炎克雷伯菌FimA基因,双酶切后将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-FimA。将pET28a-FimA转化表达菌BL21 star(DE3)后培养,使用IPTG诱导FimA蛋白表达。使用IEDG在线网站分析FimA蛋白的B细胞表位,然后用层析纯化的重组FimA蛋白免疫小鼠,获得免疫血清,ELISA检测IgG、IgG1、IgG2a和IgA.结果肺炎克雷伯菌的FimA与其他FimA蛋白同源性较低,为23.6%?30.6%。构建的重组质粒PET28a-FimA在大肠埃希菌中能表达21.6×10^3的重组FimA蛋白,经亲和层析后得到单一电泳条带的高纯度目的蛋白。用FimA蛋白免疫小鼠,获得高滴度的IgG和IgA,且IgG2a的A450值高于IgG1.结论成功构建了表达质粒pET28a-FimA,获得高纯度的重组蛋白FimA。FimA具有免疫原性,用该蛋白免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。     

肺炎克雷伯菌夹膜多糖激活AP-1 诱导人支气管上皮细胞表达 β-防御素-3

目的:观察肺炎克雷伯菌夹膜多糖(CPS)对人支气管上皮细胞表达β-防御素-3(hBD-3)的影响,并探讨其作用机制。方法:用肺炎克雷伯菌CPS刺激人支气管上皮细胞BEAS-2B。使用实时定量PCR和ELISA分别检测hBD-3 mRNA和蛋白表达的影响。测定CPS处理前后丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)以及c-Jun的磷酸化。采用MAPKs和NF-κB抑制剂或RNA干扰TLR4表达,观察其在介导hBD-3表达中的作用。采用染色质共沉淀技术检测核转录因子AP-1与hBD-3启动子的结合情况。结果:CPS处理细胞后,hBD-3 mRNA的表达呈剂量依赖性升高,ELISA获得类似结果。CPS能激活MAPKs,采用p38、ERK及NF-κB抑制剂SB203580、PD98059和PDTC处理细胞后,不影响hBD-3的表达,而JNK抑制剂SP600125处理后,hBD-3分泌明显降低。CPS可诱导AP-1亚基c-Jun磷酸化及能增强AP-1与hBD-3启动子的结合。结论:肺炎克雷伯菌夹膜多糖激活AP-1诱导人支气管上皮细胞表达β-防御素-3。     

高专医学检验专业青年教师队伍建设的实践与探索

"百年大计,教育为本;教育大计,教师为本"。青年教师因思想活跃、创新意识和能力较强而成为推动高校教育改革发展的生力军,也是教师队伍建设的关键[1]。适应高职高专医学检验专业为基层培养高等技术应用型检验人才的要求,有计划     

病原生物学实验室生物安全管理现状和对策

阐述当下高校病原生物学实验室安全问题,从建设配套的硬件设施、健全实验室规章制度、开展生物安全知识教育、建立有效的生物安全管理体系几方面入手,提出解决问题的建议和策略,即通过加强和完善实验室安全管理制度,并将生物安全教育贯穿实验教学各个环节的措施,力求营造一个高标准的实验教学环境。