脑神经肽对人胚神经细胞生长发育及对小鼠急性缺血脑组织的影响

目的和方法应用体外培养的人胚背根神经节和大脑皮层神经元，研究了神经肽对神经组织和神经细胞生长发育的影响，还通过小鼠的急性脑缺血模型研究神经肽对急性脑缺血的作用。结果发现神经肽可使背根神经节突起的长度和密度增加，皮层神经元存活数增加，神经元分化率增高，胞体增大，突起延长，细胞生长加快。超微结构观察显示神经肽可增强细胞内的合成代谢和细胞间连接。脑神经肽可使小鼠脑组织水肿较轻神经元无明显空泡，细胞超微结构改变较轻微，脑组织LDH活性高于对照组。结论神经肽对神经组织具有营养作用，并对急性脑缺血也具有保护作用。     

骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的效果及免疫调节机制

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用及相关免疫调节机制。方法:分离纯化培养BMSCs,建立EAE动物模型,随机分为CFA组、BMSCs回输CFA组、MBP组及BMSCs回输MBP组。BMSCs回输CFA组和BMSCs回输MBP组于免疫后第6天尾静脉回输BMSCs,发病高峰期取材,全部大鼠予临床评价,检测淋巴细胞和IL-17+细胞浸润及T淋巴细胞增殖情况。建立BMSCs与淋巴细胞的共培养体系,观察BMSCs在封闭IL-27后对T淋巴细胞中Th17的影响。用ELISA检测大鼠血清或细胞培养上清中相关细胞因子表达。结果:BMSCs回输MBP组与MBP组相比,发病率降低,发病时间延后,临床评分显著降低(P<0.05),炎性细胞浸润明显减轻(P<0.01),IL-17+T细胞表达显著减少(P<0.01),血清中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-23表达水平降低(P<0.05),IL-4、TGF-β和IL-27表达水平升高(P<0.05)。IL-27中和的BMSCs与病理性T细胞共培养后,细胞培养上清中TNF-α、IFN-γ和IL-23的分泌水平明显升高(P<0.05),IL-4的分泌水平降低(P<0.01),IL-17的分泌水平显著升高(P<0.01)。结论:BMSCs经静脉移植治疗可以降低EAE发病程度,其作用机制是通过降低T淋巴细胞的反应性,通过IL-27的信号传导通路抑制EAE的靶细胞Th17产生生物学效应的。     

自然杀伤细胞参与脑缺血后损伤的作用机制

目的 探讨自然杀伤细胞(NK)参与脑缺血后损伤的作用机制.方法 ①体内实验:免疫荧光检测永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)小鼠模型脑组织中NK细胞浸润情况以及干扰素(IFN)-γ表达情况;流式细胞术检测pMCAO小鼠模型脑中NK细胞浸润数目和IFN-γ表达;腹腔注射NK细胞中和抗体,流式细胞术检测pMCAO小鼠12 h脑内NK细胞浸润情况.②体外实验:建立体外血脑屏障并加入NK细胞和荧光标识的牛血清白蛋白(BSA-FITC),氧糖剥夺(OGD)实验6h后荧光分光光度计检测血脑屏障通透性;将NK细胞与小鼠神经细胞共培养,并加入IFN-γ阻断剂,OGD6h后流式细胞术检测神经细胞凋亡.结果 ①体内实验示pMCAO小鼠脑中有NK细胞浸润和IFN-γ表达,与非缺血侧相比,缺血侧的NK细胞浸润显著增多并于12 h达到高峰(P12h＜0.001);脑缺血组织中浸润的NK细胞表达IFN-γ与非缺血侧相比增多(P12h＜0.001、P24h＜0.01、P96h ＜0.05);清除体内NK细胞后,pMCAO小鼠脑内NK细胞浸润显著减少(P＜0.001),脑内IFN-γ表达显著下降(P ＜0.001).②体外实验示OGD条件下,NK细胞组与对照组相比,BSA-FITC渗透显著增多(P＜0.01);NK细胞可促进神经细胞死亡(P＜0.01).结论 NK细胞参与脑缺血损伤过程;NK细胞通分泌IFN-γ加重血脑屏障破坏和神经细胞损伤.     

心肌营养素-1在血管紧张素Ⅱ促心肌细胞肥大、损伤时的作用及意义

目的研究心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)在血管紧张素II(AngⅡ)刺激心肌细胞造成肥大、损伤时的作用及意义。方法利用AngⅡ刺激心肌细胞造成细胞肥大,光、电镜下观察细胞形态变化,免疫组化法检测CT-1蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CT-1、β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达,酶联免疫法(ELISA)定量检测心肌细胞凋亡。结果经AngⅡ刺激后心肌细胞形态变大,β-MHCmRNA表达增加,心肌细胞凋亡增多;CT-1mRNA、蛋白表达均增加;苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物(AG490)能部分抑制CT-1引起的心肌细胞肥大,并减少心肌细胞凋亡。结论CT-1参与心肌细胞肥大的过程;AG490能够抑制CT-1促心肌细胞肥大的作用,而不降低CT-1对心肌的保护作用。     

组蛋白脱乙酰基酶2在血管紧张素Ⅱ致心肌细胞肥大中的表达

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌细胞,造成心肌细胞肥大过程中组蛋白脱乙酰基酶2(histonedeacetylase2,HDAC2)的表达。方法培养原代心肌细胞,AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大,在不同时间取细胞进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),观察HDAC2mRNA表达,免疫组化法检测HDAC2蛋白表达,相差镜和电镜下观察细胞形态变化。结果经AngⅡ刺激后,相差镜下可见心肌细胞面积变大;电镜下见细胞内部结构亦发生明显的改变;HDAC2mRNA水平随着AngⅡ刺激时间延长而增高;HDAC2蛋白表达亦增加。结论AngⅡ致心肌细胞肥大过程中伴有HDAC2表达增加,HDAC2有可能参与心肌细胞的肥大机制。     

IL-12和IL-18在实验性自身免疫性神经炎中的协同作用机制

目的:研究IL-12和IL-18分别在实验性自身免疫性神经炎(EAN)中的调节机制以及IL-12与IL-18的协同作用.方法:建立P0180-199特异性T细胞系.分别用IL-12或IL-18或者IL-12和IL-18进行体外干预,将不同处理组的T细胞回输到正常的大鼠体内,建立过继免疫的EAN动物模型.应用国际分级标准和临床评分对发病鼠进行临床评定;通过免疫组化检测不同组EAN鼠坐骨神经淋巴细胞浸润;ELISA法检测相关细胞因子的变化.结果:①在IL-12和IL-18共同干预的条件下,特异性T细胞TNF-α和IFN-γ的产生均增加;②与IL-12或IL-18组相比,IL-12 IL-18组大鼠临床发病明显加重,发病时间提前;③在坐骨神经标本中,与对照组相比,IL-12 IL-18组CD4 淋巴细胞浸润数量较多,而IL-12和IL-18组CD4 淋巴细胞浸润较少.结论:经IL-12和IL-18体外干预的P0180-199特异性T淋巴细胞,通过过继免疫给正常大鼠后,诱导出严重的EAN动物模型,表现出协同增强作用.     

体外诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化及蛋白的差异表达***☆

背景：骨髓基质干细胞移植对损伤脊髓有一定修复作用，较神经干细胞移植更为理想，但疗效并不稳定，可能与其移植微环境有关。 目的：拟建立体外神经细胞微环境作用下骨髓基质干细胞的分化模型，观察其分化过程中蛋白表达的差异。 设计、时间及地点：蛋白水平的观察对照实验，于2005-07/2007-05在哈尔滨医科大学基础医学院神经生物实验室完成。 材料：Wistar成年大鼠及新生胎鼠。 方法：取新生Wistar胎鼠脊髓，以培养神经细胞。从成年Wistar大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞进行体外培养和增殖，应用红色荧光蛋白PKH26标记骨髓基质干细胞。骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养组分别将骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养，共培养组、分层联合培养组分别将标记的骨髓基质干细胞与神经细胞在体外共培养及在双层培养皿中联合培养。 主要观察指标：培养7 d后收集细胞分别进行神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光检测。应用 SELDI-TOF-MS 技术筛选骨髓基质干细胞向神经细胞分化过程中变化明显的相关蛋白进行分析。 结果：骨髓基质干细胞与神经细胞共培养和双层联合培养7 d后，骨髓基质干细胞呈类似神经细胞形态。免疫荧光检测结果示，共培养组骨髓基质干细胞的神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显高于分层联合培养组（P < 0.05），分层联合培养组明显高于单独培养对照组（P < 0.05）。骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中有5种蛋白表达发生明显变化：在分层联合培养组TIP39_RAT和CALC_RAT表达增加，为原表达量的5.344和2.805倍；INSL6_RAT，PNOC_RAT和PCSK1_RAT表达下降，为原表达量的0.380，0.499和0.437倍。 结论：在体外神经细胞微环境作用下，骨髓基质干细胞与神经细胞在共培养和双层联合培养时均能诱导分化成神经细胞，接触培养比非接触培养分化率高。骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中与5种蛋白TIP39_RAT，CALC_RAT，INSL6_RAT，PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导软骨细胞的实验研究

目的　体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并向软骨细胞表型分化 ,探讨其作为组织工程软骨种子细胞的可行性。方法　取成年大鼠股骨骨髓 ,体外培养、纯化。取第三代成年大鼠骨髓间充质干细胞 ,实验组用HG DMEM无血清培养液诱导 ;对照组用含 1 0 %胎牛血清的HG DMEM培养液自然分化。形态学观察 ,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌。结果　大鼠骨髓间充质干细胞为均一的成纤维细胞样。实验组与对照组Ⅱ型胶原免疫组化阳性率有显著差异 (P <0 .0 1 )。结论　成年大鼠骨髓间充质干细胞在特定的培养基能向软骨细胞方向转化 ,作为软骨组织工程种子细胞具有可行性     

大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究

目的　探讨缺血脑组织中树突状细胞 (DC)的来源 ,以其及是否参与脑缺血损伤的过程。方法　用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型。用免疫组化染色法 ,检测脑缺血 1h到第 6天时 ,缺血脑组织中DC(OX6 2 + )的存在 ,以及胶质细胞 /巨噬细胞 (OX4 2 + )转化成DC(OX6 2 + )的情况。同时检测活化后的DC样细胞表达MHC Ⅱ类分子的水平。结果　缺血脑半球和假手术的脑半球相比较 ,在 12hDC的数量明显增加 (P <0 .0 0 1)。在脑缺血组中 ,缺血脑半球与非缺血脑半球相比较 ,DC的数量也增多 (P <0 .0 0 1)。脑缺血第 6天 ,缺血组与假手术组进行比较 ,DC表达MHC Ⅱ类分子 (OX6 2 + OX6 + )显著升高(P <0 .0 0 1)。缺血脑半球在 1h到第 6天 ,OX4 2 + 的细胞转变成OX6 2 + OX4 2 + 的细胞逐渐增加 ,第 6天缺血脑半球与非缺血脑半球相比较显著增多 (P <0 .0 0 1)。脑缺血损伤的面积与以每 10 0mm2 脑组织切片为单位的OX6 2 + 细胞的数量呈正相关 (R2 =0 .8914 ,P <0 .0 0 1)。结论　脑缺血后 ,脑缺血组织中DC数量的增加与脑损伤的面积呈正相关 ,提示DC参与了脑缺血过程。大鼠脑缺血后 ,从胶质细胞向DC样细胞的转化是缺血脑组织中DC的来源之一。     

模拟微重力培养对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠淋巴细胞功能的影响

目的观察模拟微重力条件下实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠淋巴细胞细胞功能的变化。方法尾根免疫MBP668-86建立EAE模型;12d时处死大鼠,分离培养淋巴结细胞;利用旋转式细胞培养系统进行模拟微重力培养;不同时间点,增殖实验检测细胞增殖、流式检测细胞凋亡、T细胞亚型、Th细胞亚群变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中细胞因子的变化。结果EAE淋巴细胞针对MBP68-86抗原特异性增殖,在培养20h,60h,80h时,增殖受到抑制（t=3．859,P〈0．01;t=5．933,P〈0．001;t=7．613,P〈0．001）;40h时,增殖受到促进（t=4．015,P〈0．01）。培养24h时,微重力组坏死及凋亡细胞增高（t=3．998,P〈0．01;t=3．705,P〈0．01）,Th细胞降低（t=4．111,P〈0．01）,Th1、Th17和调节性T细胞（Treg）亚群比例升高（t=2．743,P〈0．05;t=4．362,P〈0．01;t=2．945,P〈0．05）。微重力培养40h时,IFN-γ,TNF-α浓度明显升高（t=4．056,P〈0．01;t=4．666,P〈0．01）,TGF-β、IL-6、IL4、IL-17浓度明显降低（t=2．855,P〈0．05;t=2．644,P〈0．05;t=3．154,P〈0．05;t=2．732,P〈0．05）。结论除40h外,MBP668-86。特异性淋巴细胞增殖在模拟微重力环境中被抑制;细胞死亡增多、Th细胞减少,对EAE起重要作用的细胞因子的浓度改变。