重建端粒酶活性的正常人成纤维细胞的成骨潜能研究

目的　通过重建端粒酶活性延长人成纤维细胞寿命 ,并对其成骨潜能进行研究 ,为解决组织工程骨修复种子细胞老化问题提供实验依据。方法　将人端粒酶催化亚基 (h TERT)基因用电穿孔法导入正常人原代成纤维细胞 ,用 TRAP- PCR检测细胞端粒酶活性 ,用β-半乳糖苷酶活性测定评价细胞衰老情况。在此基础上用骨形成蛋白(BMP- 2 )和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)联合诱导已重建端粒酶活性的成纤维细胞在体外培养条件下成骨 ,用四环素活体标记和茜素红染色显示钙盐结节形成。结果　转染 h TERT的人成纤维细胞能稳定表达端粒酶活性 ,培养超过 5 0代后细胞仍保持β-半乳糖苷酶阴性。经 BMP- 2和 TNF-α诱导后 ,转染后传 80代的人成纤维细胞仍可形成四环素标记和茜素红染色均为阳性的钙盐结节。结论　重建端粒酶活性、寿命延长的人成纤维细胞仍然维持了其本身所具有的成骨潜能     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾细胞因子变化的研究

目的:探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾细胞冈子的变化.方法:将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠.免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;鼻腔内接种组的TNF-α水平高于皮下注射组.结论:多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠产生一个THl型反应,从而对抗Em原头节攻击感染.     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3疫苗的构建及其表达效率

目的:构建多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)重组双歧杆菌(Bifidobaeteria bifidum,Bb)-Em Ⅱ/3疫苗,并研究EmⅡ/3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率.方法:通过PCR扩增Em Ⅱ/3抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione s-transfersse,GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Em Ⅱ/3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-Em Ⅱ/3疫苗.经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达Em Ⅱ/3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出1 759bp的Em Ⅱ/3基因;双酶切证实Em Ⅱ/3基因插入pGEX-1 λT中;PCR和双酶切证实重组Bb-Em Ⅱ/3疫苗构建成功;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了Em Ⅱ/3/GST融合蛋白.结论:成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-Em Ⅱ/3疫苗,重组质粒pGEX-EmⅡ/3在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot结果提示表达出的EmⅡ/3重组蛋白具有特异的抗原活性.     

甘精胰岛素联合瑞格列奈与胰岛素泵治疗对2型糖尿病疗效比较

目的：探讨甘精胰岛素联合瑞格列奈与胰岛素泵治疗初诊2型糖尿病的疗效。方法：选择60例初诊2型糖尿病,随机分为瑞格列奈联合甘精胰岛素组和胰岛素泵组,根据血糖水平调整用药量。观察两组治疗前后空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、餐后2 h血糖（2-hour postprandial plama glucose,2 h PG）、糖化血红蛋白A1c（glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c）和血脂变化情况。结果：治疗后A组和B组患者FBG、2 h PG、HbA1c均较治疗前明显下降（P值A组分别为0.000 3、0.000 1和0.000 2,B组为0.000 4、0.000 2和0.000 2,P＜0.05）;治疗后A组与B组总甘油三酯（total triglycerides,TG）水平明显降低,总胆固醇（total cholesterol,TC）和低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）也轻度下降,高密度脂蛋白-胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）轻度升高,组间FBG、2 h PG、HbA1c、TC、TG、HDL-C和LDL-C比较均无统计学差异（P值分别为0.42、0.24、0.35、0.48、0.17、0.54和0.54,P ＞0.05）。结论：甘精胰岛素联合瑞格列奈是治疗初诊2 型糖尿病患者的理想方案,与胰岛素泵持续皮下输注疗效相当。     

铜绿假单胞菌疫苗研究进展

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,Pa）是常见的非发酵精G专性需氧小杆菌,广泛存在于土壤、水、污物、植物和动物中,常定植于健康人的上呼吸道、肠道和皮肤等处,是免疫抑制个体重要的机会致病菌。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种以及口服接种免疫BALB/c小鼠12周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,检获泡球蚴组织,称取重量,计算减蚴率;分离脾细胞,用ConA刺激培养16~18h,然后用流式细胞仪检测脾细胞凋亡。结果疫苗免疫组小鼠检获泡球蚴质量均明显低于PBS对照组;小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组(P<0.05或P<0.01),每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组(P<0.05或P<0.01),皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4+T细胞亚群的数量,诱导宿主产生一定的保护力,对抗Em原头节攻击。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白F疫苗的研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是广泛存在于自然界中的革兰阴性(G-)杆菌，代谢的多样性决定其能在不同的环境中生存，包括土壤、水生环境、植物以及动物组织中。     

pCD-Em10对泡球蚴感染小鼠免疫应答的影响

目的：探讨pCD-Em10免疫对泡球蚴感染小鼠免疫应答的影响。方法：将pCD-Em10肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8周用Em原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比;用EmAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照。结果：pCD-Em10免疫组的减蚴率为71.17%,脾CD4^＋T细胞亚群显著增加,IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组。结论：pCD-Em10可诱导泡球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。