单细胞反转录酶聚合链式反应技术对胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子的鉴别

目的:利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法,实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子,以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法。方法:实验于2001-10/2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验。②胰岛活性测定实验中,选择1×106分化的胰腺干细胞,用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4h,检测12,14,24d培养液中胰岛素的浓度。③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中,选择12个单个胰腺干细胞进行检测,另取12个单个未分化的干细胞作为对照。聚合链式反应体系为20μL。聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min条件下循环35次。聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳。结果:①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测:培养12,14,24d时培养液中胰岛素的浓度分别为42.6,68.2,73.5IU/L,随着时间的延长,呈逐渐升高的趋势。②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果:12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性,而作为对照的12个未分化干细胞均未检出,两者差异显著(P<0.001)。结论:采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障,证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法。     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的:从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定,为神经干细胞移植寻找源泉。方法:实验于2001-02/2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织,备人胚胎大脑组织细胞悬液制免疫磁珠法分离神经干细胞,实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物,betaactin为内参对照。以结果:分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常,nestin阳性细胞纯度极高。结论:免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离,及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

T细胞特异性转录因子T-bet、GATA3调控子(癎)前期辅助性T淋巴细胞1型免疫漂移的研究

子(癎)前期是产科常见且严重的妊娠并发症,是导致围产儿及孕产妇死亡的重要原因[1].研究发现辅助性T淋巴细胞1和2(T helper 1/T helper 2,Th1/Th2)免疫状态向Th1漂移是子(癎)前期发病的重要免疫机制[1-4],因此研究子(癎)前期产生Th1型漂移的免疫调控机制有助于进一步了解其病理生理机制,目前国内外尚未见相关研究报道.     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的：从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定，为神经干细胞移植寻找源泉。方法：实验于2001-02／2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织，制备人胚胎大脑组织细胞悬液，免疫磁珠法分离神经干细胞，实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物，以beta actin为内参对照。结果：分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常，nestin阳性细胞纯度极高。结论：免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离，及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

T细胞特异性转录因子T-bet、GATA3调控子(癎)前期辅助性T淋巴细胞1型免疫漂移的研究

子(癎)前期是产科常见且严重的妊娠并发症,是导致围产儿及孕产妇死亡的重要原因[1].研究发现辅助性T淋巴细胞1和2(T helper 1/T helper 2,Th1/Th2)免疫状态向Th1漂移是子(癎)前期发病的重要免疫机制[1-4],因此研究子(癎)前期产生Th1型漂移的免疫调控机制有助于进一步了解其病理生理机制,目前国内外尚未见相关研究报道.     

Taqman-MGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变

目的:采用不同方法检测慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者的JAK2V617F突变率,评估临床应用的可能性.方法:提取84例Ph阴性CMPD患者单个核细胞DNA,利用Real time PCR联合Taqman-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患者的JAK2V6A7F的发生率,并利用限制性片段长度多态性(RFLP)对照检测CMPD患者的JAK2V617F突变率,用基因测序验证两种结果.结果:Real time PCR联合Taqman-MGB探针检测84例Ph(-)CMPD患者,42例存在JAK2V617F,突变率为50%;其中PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%(23/30)、25.9%(7/27)、42.5%(9/20),经RFLP检测84例Ph(-)CMPD总的突变率为33.3%,测序结果验证了Real time PCR联合Taqman-MGB探针检测结果.结论:Taqman-MGB探针联合Real time PCR方法有较高的准确率,可以作为检测JAK2V617F突变的方法.     

肝癌组织中人宫颈癌癌基因mRNA的表达及意义

目的 观察人宫颈癌癌基因(HCCR)mRNA在肝癌和癌旁正常组织以及肝癌患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)中的表达水平.方法 TRIZOL法提取肝癌组织和癌旁正常肝组织以及肝癌患者和正常人的PBMC的RNA,用RT-PCR技术分析HCCR基因在不同样品中的mRNA表达水平.结果 在肝癌组织中,HCCR的mRNA相对表达强度为0.776±0.101,癌旁正常组织中的相对表达强度0.470±0.154,两者相比,P＜0.05.在PBMC中,肝癌患者HCCR mRNA的表达强度为0.256±0.069,而正常人未检测出,两者相比,P＜0.05. 结论 HCCR基因可能参与了肝癌的发生与发展,与肝癌的病理过程有一定的相关性.     

肝癌患者血清和癌组织中锌指蛋白216表达增加

目的 寻找肝癌相关抗原.方法 应用SEREX技术对肝癌组织cDNA文库进行血清学筛选,获得人类锌指蛋白ZNF216.利用原核表达和亲和层析技术获得ZNF216的6*His融合蛋白,建立间接ELISA方法,检测血清中产生的ZNF216抗体水平;利用RT-PCR技术检测肝癌患者肝癌组织及癌旁组织内ZNF216 mRNA的水平.结果 肝癌患者血清中产生的抗ZNF216抗体水平高于正常个体,ZNF216 mRNA在肝癌组织内的表达明显高于癌旁组织.结论 ZNF216在肝癌病人血清及癌组织内的过表达可能参与肝癌的发生,但还需要进一步研究证明.     

应用原位杂交技术分析ZNF216基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式

目的：获得ZNF216基因的表达模式。方法：体外转录方法合成地高辛标记的CRNA探针,利用原位杂交技术检测ZNF216基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式。结果：在小鼠脑、心脏、骨骼肌和睾丸细胞内可检测到很强的ZNF216的杂交信号,在肾脏细胞内也可检测到杂交信号,但在脾脏和肝脏细胞内仅检测到少许杂交信号和未能检测到杂交信号。结论：ZNF16基因表达于几种组织细胞内,具有一定的组织特异性。