胶体金免疫层析法检测念珠菌抗原对侵袭性念珠菌肺炎的诊断价值

目的研究胶体金免疫层析法检测念珠菌抗原对侵袭性念珠菌肺炎的诊断价值。方法纳入2015年4月至2019年9月本院诊治的怀疑为侵袭性念珠菌肺炎、侵袭性曲霉菌肺炎、非真菌感染病例253例,使用我们与军事医学研究院共同研发的胶体金免疫层析试剂检测血液中念珠菌抗原。结果本研究共测定临床血液标本253例,其中诊断为侵袭性肺念珠菌感染的有30例,非真菌感染患者213例,侵袭性肺曲霉菌感染10例。胶体金法检测念珠菌的灵敏度为87%,特异性为93%,阳性预测值为63%,阴性预测值为98%。结论胶体金免疫层析法对于侵袭性肺念珠菌肺炎具有较高的灵敏度和特异性,且具有快速、方便等特点,能够用于临床念珠菌肺炎的检测。     

鲍曼不动杆菌异质性耐药研究进展

异质性耐药是指细菌的不同亚群对某种抗菌药物表现出不同的敏感性,多报道于对万古霉素中介的金黄色葡萄球菌。近年来,在以鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等为代表的革兰阴性菌中这一现象不断地被揭示,并且被逐渐认识到其可能是导致抗感染治疗失败的原因之一。细菌一旦出现异质性耐药,在抗菌药物选择性压力下,即使是小部分的耐药亚群也可表现出高水平的表型耐药,从而导致临床应用抗菌药物抗感染治疗的失败。异质性耐药体现了细菌群体从部分耐药向完全耐药转变的过程。研究异质性耐药对于认识临床常见病原菌耐药的发展过程,以及评估治疗方案和指导临床使用抗菌药物具有重要的意义。本文对鲍曼不动杆菌异质性耐药的研究现状进行了综述。     

汉坦病毒疫苗研究进展

汉坦病毒可引起HFRS和HPS两类急性传染性疾病,临床尚缺乏特异有效的治疗方案。我国是世界上受HFRS影响最严重的国家,因此针对汉坦病毒的疫苗研究工作任务紧迫。本文将对目前国内外汉坦病毒疫苗研究进展,特别是我国工作者的研究工作予以概括。     

1株高毒力型肺炎克雷伯菌临床分离株毒力及耐药性分析

目的　对1株临床分离的高毒力型肺炎克雷伯菌菌株进行毒力基因及耐药基因分析,为临床复杂肺炎克雷伯菌感染的诊断及抗生素使用提供参考。方法　首先使用PCR方法对该菌株进行血清学分型、毒力基因和耐药基因检测,然后利用二代和三代高通量测序平台对该菌株进行全基因组测序和序列拼接,应用生物信息学方法全面分析该菌株毒力基因及耐药基因。结果　该菌株血清型为K1型,采用PCR方法发现该菌株携带wabG、uge、kfuBC、aerobactin、rmpA、magA和 fimH 7个毒力基因及超广谱β-内酰胺酶耐药基因（基因型为SHV型）。高通量测序进一步发现该菌株的基因组还携带clbB、iroC和rffG 3个毒力基因。结论　该肺炎克雷伯菌临床分离株血清型为K1,除了携带喹诺酮类和β-内酰胺类耐药基因外,还含有多种毒力基因,增加了治疗难度。全面分析感染菌株携带的毒力基因和耐药基因,有针对性地选择抗生素,可提高抗感染治疗的效率,减少并发症的发生。     

联合应用泛素分子基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建含有泛素(ubiquitin , Ub)基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0 . 7和GcS0 . 7重组腺病毒. 方法 通过PCR扩增获得Ub基因, 分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7和pShuttle-pCAG-GcS0.7中,进一步通过双酶切将转移载体中的嵌合基因分别克隆入腺病毒载体, 得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7,使用Pac Ⅰ线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测表达产物. 结果 限制性内切酶酶切鉴定、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确. IFA检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达. 结论 成功制备了含有Ub基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重组腺病毒, 为进一步研究联合Ub基因的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础.     

基于游离DNA的纳米孔测序在一例肺炎病例病原识别中的应用

目的探讨游离DNA测序在呼吸道感染病原诊断中的应用价值。方法对一例肺炎病例的支气管肺泡灌洗液和血液样本提取游离DNA, 同时进行纳米孔测序和二代测序。结果纳米孔测序从肺泡灌洗液样本中检测到132条1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1, HSV-1)序列, 但从血液样本中未检出HSV-1序列。二代测序从两种样本中均检出HSV-1序列, 产生的病毒序列数与测序深度高于纳米孔测序。实时定量PCR反应和血清学检测证实了该诊断。纳米孔测序与二代测序数据混合组装后获得了HSV-1全长序列, 系统进化分析表明该病毒与美国分离的毒株亲缘关系最近。结论纳米孔测序技术可在更短时间内检测出病原, 有助于感染性疾病病原的快速诊断。     

Herceptin与卡铂联合应用对宫颈癌细胞的抑制及其机制

目的:研究自然杀伤(natural killer,NK)细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like recep-tor,KIR)和HLA-Cw配体不相合的异基因NK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用;分析杀伤活化受体NKG2D及其MICA配体表达水平与NK细胞对乳腺癌细胞杀伤敏感性之间的关系。方法:取10例健康人及5例乳腺癌患者外周血10ml,采用MACS系统NK细胞免疫磁珠分选试剂盒负向分选高纯度NK细胞。取乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-435s和SK-Br3)和NK细胞各1×105个,碱裂解法抽提DNA,PCR-SSP方法分别检测HLA-Cw位点、KIR位点表达。MTT法检测KIR相合与不相合组的NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤率。流式细胞术检测NK细胞NKG2D表达水平以及RT-PCR方法检测乳腺癌细胞MICA表达。结果:MACS系统分选出的NK细胞,经流式细胞术检测,其纯度在90%以上;KIR与HLA-Cw相合组的NK细胞对乳腺癌细胞株的杀伤率明显高于不相合组,G1组和G2组NK细胞对MDA-MB-435s(G1组)杀伤率分别为(73.2±14.5)%和(34.2±7.6)%,对SK-Br3(G1组)杀伤率为(67.3±12.5)%和(36.5±7.7)%,而对MCF-7(G2组)杀伤率分别为(36.7±8.5)%和(76.5±11.7)%。结果还显示,3株乳腺癌细胞均表达MICA分子;NK细胞与MCF-7细胞共培养,可上调NK细胞表面NKG2D的表达。结论:NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤并非由KIR的不相合机制介导;乳腺癌细胞表面表达的MICA分子可上调NK细胞表面NKG2D的表达,激发NK细胞对乳腺癌细胞的细胞毒效应。     

抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达

目的:构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中获得稳定、高效表达,并对其生物学活性进行初步鉴定。方法:利用基因重组技术将本室前期构建的含有轻、重链嵌合基因的载体PMD18-T-VH和PMD18-T-VL双酶切获得重链、轻链基因后,克隆到前期改构的高效真核表达载体pCI-neo-M中,用脂质体法转染野生型CHO-K1细胞,在G418和氨甲喋呤(MTX)双筛选压力下筛选稳定高效表达细胞株,ELISA方法检测重组蛋白的表达,用Protein A HP Spin Trap纯化目的蛋白后进行SDS-PAGE和Western blot法检测,并通过体外中和实验检测其中和活性。结果:成功构建了抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,转染CHO-K1细胞后经过3轮亚克隆筛选获得稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的细胞系,表达量约为1 mg/L,SDS-PAGE和Western blot法检测到目的蛋白的表达,微量细胞中和实验检测其中和活性,与亲本单克隆抗体(mAb)的中和活性相近。结论:抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体在CHO-K1细胞中成功表达,并具有良好的中和活性,为该抗体进一步的实验研究和临床应用奠定了基础。     

汉坦病毒S0.7基因新型重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建含汉坦病毒核蛋白(NP)氨基端编码基因S0.7,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的新型重组腺病毒。方法:依据GenBank序列,分别合成CAG序列及WPRE序列,插入S0.7-pShuttle中,构建含S0.7基因,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的转移载体pShuttle-S0.7-CAG-WPRE。采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶将该片段克隆入腺病毒DNA,得到重组腺病毒DNAAdeno-S0.7-CAG-WPRE,使用PacI线性化后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒。感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果:转移载体pShuttle-S0.7-CAG-WPRE通过测序证明构建正确,纯化重组腺病毒滴度达1013pfu/L。免疫荧光结果表明,重组腺病毒感染的HEK293细胞被抗汉坦病毒NP的特异性mAb1A8所识别。结论:成功地构建了含汉坦病毒S0.7基因,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的新型重组腺病毒,本实验为进一步研制汉坦病毒基因疫苗奠定了良好的基础。     

联合应用抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有抗原加工递呈分子基因HSP70C的HTNV嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒。方法通过PCR扩增获得HSP70C基因,分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7及pShuttle-pCAGGcS0.7中,进而构建新的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7-HSP70C及pShuttle-pCAG-GcS0.7-HSP70C。进一步通过双酶切将转移载体中的目的嵌合基因再分别克隆入腺病毒载体,得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-GnS0.7-HSP70C、rAd-pCAG-GcS0.7-HSP70C,使用Pac I线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果经过酶切、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确。免疫荧光实验检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达。结论成功制备了含抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒,为进一步研究构建的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础。