玻璃体内注射他克莫司对异种移植的视网膜色素上皮细胞存活的影响

目的 观察少量、多次玻璃体内注射免疫抑制剂他克莫司（FK506）对移植到兔眼视网膜下间隙内的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞存活情况的影响。 方法 采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）逆转录病毒感 染人RPE细胞。将50 μl（4×10³个/μl）表达GFP的人RPE细胞悬液注射到18只白兔及1 0只灰兔双眼视网膜下间隙，手术后所有兔左眼玻璃体内注射5 μl FK506（5 μg/ μl），每周1次，连续5周，然后间周一次至20周;右眼不注射作为对照。眼球壁铺片倒置荧光 显微镜观察移植细胞的存活状态。 结果 白兔于移植后1、2、3、4 、6、10、11、14、18、20、23、24、25、33、54周，灰兔于移植后4、5、6、7、14、18、20、26周双眼视网膜下均可见表达的GFP细胞，但移植术后1~14周内玻璃体内注射了FK506的左眼视网膜下RPE-GFP细胞形态、细胞膜的完整程度均比未注射的右眼好。18周后，7只白兔和3只灰兔双眼视网膜下移植细胞的状态差异不明显。眼球切片苏木素-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察结果显示，移植术后1~6周，6只白兔和3只灰兔右眼脉络膜小血管周围可见灶性或弥散的淋巴细胞，应用了FK506的左眼淋巴细胞的浸润明显减少。 结论 移植术后早期玻璃体内使用小剂量免疫抑制剂可减轻局部炎症反应，有利于维持视网膜下间隙移植的异种细胞的存活。 （中华眼底病杂志，2003，19：333-404）     

绿色荧光蛋白标记的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型

目的 建立新型裸鼠脉络膜恶性黑色素 瘤原位移植瘤模型。 方法 利用脂质体将绿色荧光蛋白（GFP）真核表达 质粒pEGFP-N₁转入人脉络膜恶性黑色素瘤细胞（OC-1），新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。将2 μl细胞浓度为4.5×10⁷~5.5×10⁷个/ml的细胞悬液注射到麻醉后的40只裸鼠右眼视网膜下间隙，左眼不注射作为对照眼。手术后利用带荧光的体视显微镜连续观察肿瘤生长情况，分别于肿瘤生长的眼内期、眼外期及衰竭期处死动物，荧光显微镜观察裸鼠视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况，并行肿瘤组织的GFP免疫组织化学染色。 结果 手术后10~12 d肿瘤开始生长，血管扩张、扭曲，新生血管形成；手术后20~22 d肿瘤占满玻璃体腔；手术后24~26 d肿瘤生长至眼外；眼外期后，迅速进入衰竭期，衰竭期嗅球、肾、肺、肝脏有转移灶。移植瘤病理组织学表现类似于人脉络膜恶性黑色素瘤；免疫组织化学染色肿瘤细胞GFP染色阳性。 结论 以GFP基因标记的OCM-1经裸鼠视网膜下间隙移植建立的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型，为研究自然状态下肿瘤的生长和转移提供了一个新的方法。 （中华眼底病杂志，2004，20：245-248）     

一种新的高转移膀胱癌动物模型的建立

目的　建立一种简便、可靠的小鼠膀胱癌模型。方法　将绿色荧光蛋白 (GFP)表达质粒导入小鼠膀胱癌细胞株BTT T73 9,G418筛选稳定表达GFP的克隆。然后接种于同系小鼠膀胱壁内及后腿皮下 ,荧光显微镜直接观察肿瘤细胞生长、浸润与微转移 ,流式细胞术定量分析转移的肿瘤细胞数 ,并与常规石蜡切片苏木素 伊红 (HE)染色比较。结果　经GFP标记的肿瘤细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光 ,膀胱原位接种 (2～ 4)× 10 5后 1周即出现膀胱肿大、血尿 ,以后膀胱肿大加重、出现输尿管阻塞、肾盂积水 ,以及肾、腹腔、肺、肝、脾等远处转移。结论　GFP标记的BTT T73 9膀胱癌细胞和膀胱癌动物模型可十分简便、准确判断膀胱癌肿瘤细胞生长、浸润与微转移等。     

睫状神经营养因子及其受体在正常及变性视网膜中表达水平与分布的变化

目的 观察正常Sprague-Dawley（SD）和遗传性视网膜变性Royal College of Surgeons (RCS)大鼠视网膜发育过程中睫状神经营养因子(CNTF)及其受体(CNTFR)的表达水平与分布特点。 方法 新生至成年(12个月龄) SD和RCS大鼠视网膜石蜡切片，免疫组织化学染色显示睫状神经营养因子及其受体表达水平和分布变化。 结果 出生后0～7 d,SD大鼠神经视网膜全层染色呈阳性，随着周龄增加，节细胞染色明显增强，而其他细胞染色减弱，至28 d时节细胞染色达高峰，并持续至老年；RCS大鼠视网膜CNTF免疫组织化学染色结果与SD大鼠基本相同。出生后0～3 d, SD大鼠神经视网膜全层CNTFR的表达呈弱阳性，节细胞染色稍深，在将来要发育成外节处可见断续阳性染色；随着周龄增加，光感受器外节处阳性染色逐渐增强，14～28 d染色达到高峰；56 d时外节染色减弱，而节细胞染色却明显增强，直至老年。3～14 d RCS大鼠视网膜CNTFR染色基本与同龄SD大鼠一致，但21 d起外节染色明显减弱，28 d时外节染色基本呈阴性，但节细胞仍呈强阳性，一直持续到老年。 结论 CNTF的表达在正常和变性大鼠间无明显差异；CNTFR主要在节细胞和光感受器外节处高水平表达，正常和变性RCS大鼠间存在显著差异，为利用CNTF治疗视网膜变性提供了实验证据。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 120-123)     

大鼠视网膜神经节细胞发育分化及免疫组织化学染色特征

神经节细胞是视网膜的主要组成成分,其轴突构成视神经,在视觉信号的传导过程中起重要作用。Thy1.1被认为是视网膜神经节细胞的标志物,不少研究报道利用Thy1.1抗体分离纯化并鉴定视网膜节细胞[1]。我们利用多种神经细胞特异抗体,检测分析不同发育时期的大鼠视网膜节细胞染色特征,为全面了解节细胞的生物学特征,对其正确识别和区分节细胞提供了新的实验证据和工具。1材料和方法选取纯种Spregue-Dawley(SD)及Wistar大鼠各3对进行繁殖,其子分别于出生后0、1、3d,1、2周,1、2、4、5、12个月时(每个时间点各3~5只)麻醉后处死,摘除双眼立即放入5…     

THP-1源性巨噬细胞载脂蛋白EmRNA的表达(摘要)

1　材料与方法ＴＨＰ-1细胞(中科院细胞所);佛波醇酯(Ｓｉｇｍａ公司);载脂蛋白ＥＰＣＲ引物:①5’-ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣ-3’;②5’-ＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡ-3’。将ＴＨＰ-1细胞接种至12孔板,实验组(加10-7ｍｏｌ/Ｌ佛波醇酯)4孔;对照组(不加佛波醇酯)4孔。四天后收集细胞抽提细胞总ＲＮＡ,取总ＲＮＡ500ｎｇ,逆转录生成ｃＤＮＡ;取逆转录产物5μＬ,ＰＣＲ扩增,循环30次:95℃1ｍｉｎ→63℃1ｍｉｎ→72℃1ｍｉｎ。扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描系统检测扩增产物的量…     

高糖与炎症因子及黄芪对人腹膜问皮细胞毒性的影响

目的 :研究不同浓度的含糖腹透液、多种炎症因子以及二者的共同作用对人腹膜间皮细胞损伤的影响 ,并探索中药黄芪对此的干预作用。方法 :用乳酸脱氢酶 (LDH)释放法测定细胞毒性 ,观察各种因素 (不同浓度的含糖腹透液与炎症因子的组合、多种炎症因子及其组合和中药黄芪 )对体外培养人腹膜间皮细胞株损伤的影响。结果 :4 .2 5 %腹透液使细胞破坏明显增加 ,P <0 .0 5 ;4 .2 5 %腹透液 +TNF -α或 (LPS +TNF -α +IL - 1β)进一步加剧细胞损伤 ,P <0 .0 5和P <0 .0 1。黄芪明显减少细胞破坏 ,在 1.5 %腹透液情况下 ,P <0 .0 0 1;在TNF -α和LPS +TNF -α+IL - 1β情况下 ,P <0 .0 5。结论 :黄芪减少腹膜间皮细胞损伤 ,在炎症因子或含糖腹透液条件下 ,黄芪仍有保护间皮细胞的作用     

经绿色荧光蛋白基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp的生物学行为与基因表达

目的 研究经绿色荧光蛋白（GFP）基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp在小鼠体内的生长过程、转移规律，以及可能影响肿瘤生长和转移的因素。 方法 用脂质体将GFP基因导入人脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，建立稳定、高水平表达GFP的克隆;分别接种到Balb/c裸鼠视网膜下和后大腿皮下，建立原位和异位肿瘤模型。眼内肿瘤生长情况用荧光显微镜直接观察，皮下肿瘤大小用游标卡尺测量;采用免疫组织化学方法对肿瘤内13种基因的表达进行检测。 结果 稳定表达GFP的脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1-gfp基本保持了亲代细胞的特征;能在裸鼠体内形成肿瘤并继续生长和转移;在基因表达方面，肿瘤抑制基因p16染色呈阴性，p53染色呈强阳性。其他的肿瘤抑制基因:视网膜母细胞瘤易感基因（Rb）、p21，转录调控因子（E-2F）、核因子κB（NFκB），细胞增生相关基因细胞周期素D1（cyclin D1）、增生细胞核抗原（PCNA），细胞凋亡相关基因bcl-2、bcl-XL/S和bax，以及表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）呈现不同程度的阳性表达。 结论 GFP为直接观察脉络膜黑色素瘤在体内的生长和转移提供了标记;脉络膜黑色素瘤原位与异位移植瘤模型在成瘤率和生长情况方面无明显差异;由OCM-1-gfp生长形成的肿瘤p16、p53及NFκB、cyclin D1、PCNA及EGF和EGFR等多种基因表达异常。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 170-173)     

人视网膜发育分化过程中基质金属蛋白酶9表达的变化

目的 观察人视网膜发育和分化过程中基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平与细胞分布特点,探讨其在人视网膜发育和分化过程中的可能作用.方法 胚胎发育早期、中晚期及成人视网膜石蜡切片,抗MMP-9免疫组织化学染色,观察MMP-9表达水平和分布的变化.结果 胚胎发育早期的视网膜仅在外成神经细胞层的外侧可见弱阳性细胞;胚胎发育中期外成神经细胞层的外侧,即将来要发育成盘膜处出现明显的特异性染色,而其他细胞染色仍然较弱;成人视网膜的外核层出现显著的特异性染色细胞,胞质明显着色,胞体轮廓清晰,并可观察到锥体的结构以及突触的特异染色,判断这些细胞主要是光感受器细胞中的视锥细胞.结论 MMP-9在视网膜中的表达与视网膜的成熟和细胞分化关系密切,在光感受器中的视锥细胞高水平表达,提示MMP-9可能参与视觉信号的处理.     

人LYVE-1基因联合小鼠GMC-SF基因干预小鼠膀胱癌的生长和转移

目的:研究人淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor- 1, LYVE-1 )联合小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMC-SF)干预小鼠膀胱癌的生长和转移.方法:通过人和小鼠的肺组织扩增LYVE-1基因的cDNA,构建真核表达载体phLYVE-1和 pmLYVE-1,采用脂质体转染体外培养的小鼠膀胱移行细胞癌BTT-T739细胞、小鼠成纤维细胞株NIH-3T3和人胚肾细胞株AD293,用电穿孔法转染小鼠肌肉组织.采用Western印迹法验证LYVE-1蛋白的表达.用电穿孔法将phLYVE-1联合pmGMC-SF导入T739小鼠肌肉内,1周后皮下接种膀胱移行细胞癌BTT-T739-gfp细胞,观察肿瘤生长、淋巴结转移及全身转移情况.结果:成功构建真核表达载体phLYVE-1和 pmLYVE-1.经Western印迹法检测证实,phLYVE-1和 pmLYVE-1能在被转染的细胞和小鼠肌肉组织中有效表达.预先接受了phLYVE-1和pmGMC-SF的小鼠,BTT-T739移植瘤的生长减慢,肿瘤体积小于对照组,且肿瘤肺转移明显减少,肿瘤附近和远处淋巴结增大并呈现明显的增生反应.结论:异种同源LYVE-1基因联合小鼠GMC-SF基因干预对小鼠膀胱移行细胞癌的生长和转移有抑制作用.