腺病毒介导的肿瘤血管靶向的体外自杀基因治疗研究

本工作在血管内皮细胞中分别建立了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统,用于抑制实体肿瘤中血管生成的研究.构建含自杀基因的重组腺病毒AdCMVtk和AdCMVcd,滴度均1×10~(12)pfu/ml.病毒感染小鼠血管内皮细胞lGll(MOI=100),并鉴定自杀基因的表达,测定原药对它们的杀伤.生长抑制试验表明,GCV对lGll/Ad-tk细胞杀伤的IG_(50)为0.2μmol/ L,5-FC对lGll/Ad-cd细胞杀伤的IC_(50)为20μmol/L.电镜下显示被原药杀伤的血管内皮细胞有明显的细胞凋亡现象.同时混合细胞实验证明两系统均存在明显的旁杀伤效应.从而在体外水平证明了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统杀伤增生血管内皮细胞的有效性.     

人原发性肝癌基因的实验研究───肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８～７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα重组ＤＮＡ用磷酸钙包裹后直接进行瘤内注射，发现裸鼠外周血ＴＮＦα水平有一过性增高，３周后测量瘤体大小，发现实验组的肿瘤体积明显小于对照组（２．５±１．６ｃｍ比３．２±１．８ｃｍ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０５），实验组荷瘤裸鼠的生存时间亦明显延长（４４．０±３．３ｄ比２８．２±２．０ｄ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）。结果表明，应用ＴＮＦα基因转移进行肝癌的基因治疗是一条值得探索的途径。     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达克隆SMMC7721-TNF体外抗瘤活性及其可能机制的初步研究

应用逆转录病毒载体介导人TNFα基因感染人肝癌细胞株SMMC7721，经G418筛选获得一稳定高表达SMMC7721-TNF，观察SMMC7721-TNF细胞及其培养液上清对SMMC7721和BEL7404肝癌细胞的抗瘤效应，结果表明SMMC7721-TNFα细胞本身对两种细胞均无明显的杀伤作用，但其培养液上清对这两种细胞均具有明显的抑制作用，     

脂质体－白细胞介素－2基因复合物瘤体内注射治疗肝细胞癌的实验研究

以阳离子脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导含人白细胞介素一２（ＩＬ－２）基因的真核表达质粒ｐＭＥ１８Ｓ－ＩＬ－２转染体外培养和体内成瘤的小鼠肝癌ＨＡＣ细胞，观察ＩＬ－２基因转染的肝癌细胞表达ＩＬ－２情况及对肝癌的治疗作用。结果：体外转染ＩＬ－２基因４８小时后在培养上清中可测得人ＩＬ－２活性，９６小时达最高峰（７６Ｕ／ｍｌ）；瘤体内转染后，发现治疗组小鼠生存时间明显延长（３２．１±９．４ｄ比２０．９±７．５ｄ，Ｐ＜０．０１），肿瘤体积明显小于对照组，瘤组织内可检出ＩＬ－２的ｍＲＮＡ。实验表明，脂质体－ＩＬ－２基因复合物直接注射人瘤体后可获局部ＩＬ－２基因表达，从而诱生机体抗肿瘤效应，这为肝癌基因治疗提供了一种简便实用的模式。     

hGM—CSF基因转导的人胃癌,肝癌细胞研究

ｈＧＭ－ＣＳＦ是一种细胞因子，能通过多种机制激活机体免疫功能。为了研究ｈＧＭ－ＣＳＦ修饰的人肝癌、胃癌细胞的免疫功能的变化，将含该基因的逆转录病毒载体ＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选较高滴度病毒分泌株（滴度为１．５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ），用病毒上清感染肝癌（ＨＨＣＬ）和胃癌（ＭＫＮ４５），筛选后测ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，最高分别为２７１Ｕ／１０６细胞·２４小时和２４３．８０Ｕ／１０６细胞·２４小时。ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在肝、胃癌细胞中整合，未发生重排。ＭＨＣ分子测定结果显示经修饰的肝癌ＨＨＣＬ细胞ＭＨＣ分子的表达无改变，而修饰后胃癌细胞ＭＫＮ４５的ＭＨＣⅠ类分子表达明显增加。本实验为今后瘤苗研制提供了资料。     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中的表达

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ导入人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中的细胞培养上清中可检测到ＴＮＦα的一过性表达。结果提示ＴＩＭ可成为获取ＴＮＦα基因的来源，获得的ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ重组质粒为肝癌的基因治疗奠定了基础。     

转TK基因的人肺腺癌细胞对三种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的重组逆转录病毒载体LTKSN，经PA317细胞包装后，感染人肺腺癌细胞株A549。用G418筛选到稳定表达HSV－TK基因的细胞克隆A549／TK，A549／TK与野生型A549细胞相比，生长曲线无明显差异，细胞形态亦无改变。细胞毒试验证明．HSV－TK对GCV的敏感性很高，半杀伤浓度IC50为0．5μmol／L，比野生型细胞提高了1000倍。三种不同的原药GCV、ACV和BVDU对A549／TK具有效果不等的杀伤作用。旁杀伤效果十分明显，低浓度GCV就可以将含33％A549／TK的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死。     

肝癌专一性调控元件驱动下的自杀基因治疗研究

肿瘤专一的自杀基因治疗就是将自杀基因(又称药物敏感基因，例如HSV-TK和EC-CD基因等)选择性地导入肿瘤细胞。自杀基因在肿瘤细胞中的专一性表达将使无毒的药物前体转变成细胞毒性药物，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞而减少或避免对正常细胞或组织的损伤的目的。自杀基因在肿瘤细胞中的专一性表达可以通过利用肿瘤细胞专一性基因表达调控元件来实现。     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，