刘平教授治疗非酒精性脂肪性肝炎遣方用药经验探析

近年来,中医药在非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic sfeatohe patitis,NASH)的治疗中逐渐显示出一定的优势,但对于NASH的证候分类及治疗尚未形成统一的认识,仍处于百家争鸣阶段.笔者有幸师从刘平教授,耳濡目染,受益良多,本文就先生对NASH中医辨证施治的认识、临证遣方用药经验以及115例NASH患者观察资料进行总结与分析.     

黄芪汤组分抑制胆汁淤积性肝纤维化大鼠胆管上皮细胞增殖及其转分化的效应

目的 探讨胆管上皮细胞增殖及其转分化在肝纤维化形成过程中的作用及黄芪汤组分抑制肝纤维化的效应和机制.方法 30只SD雄性大鼠采用胆总管结扎制备胆汁淤积性肝纤维化模型,假手术对照组仅对胆总管作分离,不结扎.胆管结扎术后l周随机分为模型对照组和药物干预组(经灌胃给予黄芪汤组分4周),5周后麻醉下处死大鼠,获取肝组织与血清标本.检测肝功能、肝组织学及羟脯氨酸(Hyp)含量;激光共聚焦显微镜观察肝组织角蛋白-7(CK7)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共定位,Western blot检测CK7、α-SMA蛋白表达.计量资料比较采用单因素方差分析中的LSD法或非参数检验中的H检验进行统计学分析,计数资料采用Radit检验,CK7与α-SMA蛋白表达间关系采用直线回归与相关分析.结果 与假手术对照组比较,模型对照组大鼠病死率33.3%,腹水出现率90%,肝功能显著异常,肝组织肝细胞显著减少,胆管上皮细胞及纤维组织大量增生,肝组织Hyp含量、CK7及α-SMA蛋白表达显著增加(P值均<0.01),并有大量的CK7及α-SMA共定位阳性细胞表达.与模型对照组比较,药物干预组大鼠病死率、腹水出现率及脾脏质量均显著降低(P值均<0.05),肝功能显著改善,肝组织肝细胞减少及胆管上皮细胞与纤维增生程度轻,CK7与α-SMA共定位阳性细胞显著减少.药物干预组与模型对照组大鼠肝Hyp含量分别为(1026.8±132.47)μg/g和(887.4±95.56)μg/g,CK7表达量分别为0.812±0.298和0.318±0.143,α-SMA蛋白表达量分别为0.787±0.277和0.341±0.119,差异均有统计学意义(JD值均<0.01).结论 黄芪汤组分可有效抑制胆管结扎大鼠胆管上皮细胞增生及胆管上皮细胞向α-SMA阳性的肌成纤维细胞的转分化.     

一贯煎影响CCl4大鼠肝硬化形成期肝组织基因表达谱的效应机制研究

目的：探讨一贯煎对CCl4诱导大鼠肝硬化形成阶段肝组织基因表达谱的影响。方法：首次大鼠皮下注射CCl4 3mL／kg，此后以50％CCl4橄榄油溶液2mL／kg皮下注射，每周2次，共计12周，自第9周开始给与药物干预4周，12周末杀鼠取材；检测肝功能，肝组织病理，肝组织羟脯氨酸含量，并采用基因芯片技术探讨一贯煎对模型大鼠肝组织基因表达谱的影响。结果：（1）模型大鼠8周时呈慢性肝损伤肝纤维化的病理改变，12周时已形成典型的肝硬化；与正常大鼠比较，12周时模型大鼠精氨酸加压素1A受体（AVPR1A）、CYP3A13、p球蛋白（Betaglo）等基因表达显著下调；淋巴毒素A（LTA）、MMP-23、RNA结合基序蛋白3（RBM3）、血小板反应蛋白2（TSP2）、AP1γ亚单位结合蛋白1（AP1GBP1）、生长素释放素受体（GHRHR）、阿米洛利结合蛋白1（ABP1）等基因表达显著上调。（2）与12周模型对照组比较，一贯煎组AVPRIA、CYP3A13、Betaglo等基因表达显著上调；LTA、MMP-23、RBM3、TSP2、AP1GBP1、GHRHR、ABP1等基因表达显著下调。结论：一贯煎抑制CCl4诱导大鼠肝硬化形成的作用机制与提高肝脏生物转化功能、抑制肝脏炎症反应、抑制肝细胞凋亡和肝星状细胞活化、抑制肝窦内皮损伤、改善肝脏糖代谢及水钠潴留等多种途径有关。     

肝细胞向胆管上皮细胞转分化在继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维化形成中的作用及黄芪汤组分的干预效应

目的探讨肝细胞向胆管上皮细胞转分化在继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维化形成中的作用及黄芪汤组分抑制肝纤维化的效应机制。方法 75只SD雄性大鼠,采用胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)制备继发性胆汁淤积性肝纤维化模型,假手术组(Sham)仅作胆总管分离,不作胆总管结扎。大鼠BDL术后1周随机分为对照组(M)与干预组(Y组,经灌胃给予黄芪汤组分4周),Sham组于术后1周末随机抽取5只大鼠处死取材,M组分别于术后1、2、3、4周末随机抽取5只大鼠做动态观察,余下各组大鼠均于术后第5周末处死取材。观测肝脏组织学及羟脯氨酸(Hyp)含量;激光共聚焦显微镜观察肝组织胆管上皮细胞标志物角蛋白-7(CK7)与肝细胞特异性抗原(HepPar)共定位,Western blot检测CK7、HepPar的蛋白表达,IPP软件分析肝组织天狼猩红胶原染色。结果随着造模时间推移,M组大鼠肝组织肝细胞Hep Par阳性细胞逐渐减少(ShamM1周M2周M3周M4周M5周),胆管上皮细胞(CK7阳性细胞)及纤维化程度、Hyp含量、CK7蛋白表达均逐渐增加(ShamM1周M2周M3周M4周M5周),CK7/Hep Par共定位细胞于术后1周即见增加,术后3周达到峰值,然后渐趋减少,肝组织Hep par蛋白表达量与CK7蛋白表达量呈显著负相关,Hep Par阳性细胞表达量与CK7阳性细胞表达量、胶原沉积程度均呈显著负相关,而CK7阳性细胞表达量与胶原沉积程度呈显著正相关;与M组比较,Y组大鼠死亡率、CK7阳性细胞、纤维化程度、肝组织Hyp含量、CK7蛋白表达量均显著下降(P0.01),Hep Par阳性细胞及Hep Par蛋白表达含量显著增加。结论肝细胞向胆管上皮细胞转分化可能是继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维化形成过程中的关键病理环节,抑制肝细胞向胆管上皮细胞转分化可能是黄芪汤组分有效干预继发性胆汁淤积性肝纤维化的主要效应机制之一。     

基于差异蛋白质组学解析一贯煎对大鼠肝硬化形成的影响

目的：基于差异蛋白质组学探讨一贯煎干预肝硬化的部分效应机制。 方法：48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组（n=12）及造模组（n=36）,采用50％四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）-橄榄油溶液1 mL/kg腹腔注射（2次/周,共9周）制备大鼠肝硬化模型。于开始造模后3周和6周分别随机处死6只大鼠,作药物干预前的动态观察,其余24只模型大鼠于开始造模后第7周首日随机分为模型组（n=12）及一贯煎干预组（n=12）。大鼠于第9周末全部处死取材。双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）分离肝组织总蛋白,基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱及数据库查询鉴定差异表达蛋白质;差异蛋白质铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase, Cu/Zn SOD）和DJ-1表达采用蛋白印迹法及免疫组织化学方法进行验证。 结果：获得分辨率高、重复性好的肝组织2-DE图谱,经质谱鉴定的50个差异蛋白质中,与氧化应激相关的5个蛋白质分别是Cu/Zn SOD、DJ-1、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-转移酶Yb-1亚基、醛酮还原酶7,A2。与正常组大鼠比较,模型组肝组织Cu/Zn SOD、DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶及醛酮还原酶7,A2的表达均显著降低,其中Cu/Zn SOD、醛酮还原酶7,A2在造模3周、6周及9周后呈梯级下降,而DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶于造模3周、6周及9周后均呈低水平表达;谷胱甘肽合成酶表达显著升高。治疗结束后与模型组比较,一贯煎组Cu/Zn SOD、DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶及醛酮还原酶7,A2表达均明显增高,谷胱甘肽合成酶表达显著降低。蛋白印迹法及免疫组织化学验证了Cu/Zn SOD、DJ-1在蛋白表达水平的差异,与蛋白质组学结果基本一致。 结论：抗氧化应激功能降低是CCl4致大鼠肝硬化的重要病理环节,提高抗氧化应激功能相关蛋白的表达可能是一贯煎治疗CCl4所致大鼠肝硬化的主要效应机制。     

一贯煎影响CCl4大鼠肝硬化形成期肝组织基因表达谱的效应机制研究

目的:探讨一贯煎对CCl4诱导大鼠肝硬化形成阶段肝组织基因表达谱的影响。方法:首次大鼠皮下注射CCl43mL/kg,此后以50%CCl4橄榄油溶液2mL/kg皮下注射,每周2次,共计12周,自第9周开始给与药物干预4周,12周末杀鼠取材;检测肝功能,肝组织病理,肝组织羟脯氨酸含量,并采用基因芯片技术探讨一贯煎对模型大鼠肝组织基因表达谱的影响。结果:（1）模型大鼠8周时呈慢性肝损伤肝纤维化的病理改变,12周时已形成典型的肝硬化;与正常大鼠比较,12周时模型大鼠精氨酸加压素1A受体（AVPR1A）、CYP3A13、β球蛋白（Beta-glo）等基因表达显著下调;淋巴毒素A（LTA）、MMP-23、RNA结合基序蛋白 3（RBM3）、血小板反应蛋白2（TSP2）、AP1γ亚单位结合蛋白1（AP1GBP1）、生长素释放素受体（GHRHR）、阿米洛利结合蛋白 1（ABP1）等基因表达显著上调。（2）与12周模型对照组比较,一贯煎组AVPR1A、CYP3A13、Beta-glo等基因表达显著上调;LTA、MMP-23、RBM3、TSP2、AP1GBP1、GHRHR、ABP1等基因表达显著下调。结论:一贯煎抑制CCl4诱导大鼠肝硬化形成的作用机制与提高肝脏生物转化功能、抑制肝脏炎症反应、抑制肝细胞凋亡和肝星状细胞活化、抑制肝窦内皮损伤、改善肝脏糖代谢及水钠潴留等多种途径有关。     

茵陈蒿汤干预二甲基亚硝胺大鼠肝硬化效应的方证病理学基础研究

目的基于清热利湿与滋养肝肾不同功效古典方剂的干预效应,探讨二甲基亚硝胺(dimethylni-trosamine,DMN)诱导大鼠肝硬化的方证病理学基础。方法腹腔注射DMN4周制备大鼠肝硬化模型,造模2周末取6只模型大鼠作给药前观察,其余模型大鼠随机分为模型对照组、茵陈蒿汤(yinchenhao Decoc-tion,YCHD)组及一贯煎(yiguanjian,YGJ)组;各组于继续造模同时给予不同方剂的煎剂经口灌胃2周,正常大鼠与模型对照组给予同量等渗盐水,4周末处死大鼠,获取血清与肝组织样品,观测肝功能、肝组织病理学、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,检测肝组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性;免疫印迹检测肝组织α-SMA、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、血小板衍生生长因子(platelete-derived growth factor,PDGF)以及肝脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid bindingprotein,L-FABP)、转铁蛋白(transferrin,Tf)表达的变化。结果与模型对照组比较,YCHD组肝功能显著改善;肝组织Hyp含量与α-SMA蛋白表达显著降低(P0.05),显著抑制DMN大鼠肝硬化的形成,而YGJ无明显作用。肝组织TNF-α与PDGF表达在YCHD组显著减少,而YGJ组TNF-α进一步增加,PDGF无明显变化;YCHD组肝组织MDA含量与GST活性显著降低(P0.01或P0.05),GSH含量、L-FABP及Tf蛋白表达显著增加(P0.05),而YGJ组仅见GSH显著增加(P0.05)。结论茵陈蒿汤显著抑制DMN大鼠肝硬化的形成;DMN大鼠肝硬化形成期的肝组织炎性病变及其过氧化损伤是茵陈蒿汤清热利湿效应的方证病理学基础。