基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用

目的构建以肺部苦味受体TAS2R14为靶点的高通量筛选细胞模型,为寻找高效、低毒的新型抗哮喘天然药物奠定基础。方法利用同源重组技术将TAS2R14受体基因插入p LVX-basic质粒,构建p LVX-Ac GFP1-N1-TAS2R14重组载体,并将其转染入HEK293T细胞,建立特异性高表达TAS2R14受体基因的细胞株。利用该细胞模型对120种苦味中药提取物和单体化合物进行高通量筛选。结果建立的模型Z′因子为0.69和0.66,筛选发现陈皮提取物及其药效物质柠檬苦素,白果提取物及其药效物质芦丁、奎宁对TAS2R14受体具有显著的激动作用。结论建立的TAS2R14受体激动剂高通量筛选模型稳定性好、灵敏度高,筛选得到的3种中药单体具有潜在的TAS2R14受体激动活性。     

克白颗粒抗白癜风的体内外药效研究

目的 研究克白颗粒抗白癜风的体内外药效,并对克白颗粒进行安全性评价。方法 采用血清药理学实验方法检测克白颗粒含药血清对小鼠黑色素瘤细胞B16f10增殖能力的影响;选取50只健康豚鼠随机分成正常对照组、模型对照组及克白颗粒高、中、低剂量(9.04,4.52,2.26 g·kg^-1·d^-1)组,每组10只,除正常对照组外,其余各组采用化学脱色法连续涂抹7%H₂O₂ 50 d,制备实验性白癜风豚鼠模型,肉眼观察各给药组对实验性白癜风豚鼠模型的疗效,检测豚鼠血液中酪氨酸酶(TRY)、胆碱酯酶(CHE)、单胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)的含量;长期毒性实验对克白颗粒进行安全性评价。结果 血清药理学实验表明克白颗粒含药血清能够显著促进B16f10细胞的体外增殖。造模后,模型组豚鼠血清MDA、MAO含量显著升高(P<0.05),CHE、TRY含量显著降低(P<0.05或0.01);与模型对照组比较,克白颗粒高剂量显著降低血清中MDA含量(P<0.01),高、中剂量显著降低MAO的含量(P<0.05)、显著升高CHE的含量(P<0.05),但对TRY含量无显著影响。长期毒性实验结果显示克白颗粒对SD大鼠脏器重量无显著影响。结论 克白颗粒显示出良好的抗白癜风效果,其作用机制可能与调节血液中CHE、MAO、MDA含量、促进黑色素细胞增殖有关。     

茶条槭总黄酮提取物抗小鼠肝纤维化作用及其机制研究

目的研究茶条槭总黄酮提取物(AF)对四氯化碳(CCl 4)致小鼠肝纤维化的保护作用及其作用机制。方法将60只小鼠随机分为模型组、空白对照组、茶条槭总黄酮提取物(AF)高、中、低剂量组(给药剂量分别为400,200和100 mg·kg^-1)和秋水仙碱组(4 mg·kg^-1)。除空白对照组外,其余5组用0.4 g·mL^-1的CCl 4腹壁皮下注射复制小鼠肝纤维化模型,用HE及Masson染色观察肝组织病理变化,用生化试剂盒检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和层黏连蛋白(LN)的含量以及Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的表达水平;用Elisa法检测血清白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-6(IL-6)的表达水平;用免疫组化染色检测小鼠肝脏α-肌动蛋白(α-SMA)的表达水平;用Real-time PCR检测肝组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和信号转导分子-2(SMAD2)mRNA的表达情况;用Western blot技术检测肝组织TGF-β1和SMAD-2的蛋白表达水平。结果与模型组比较,AF高、中剂量组血清ALT、AST、LN含量及Col-Ⅳ、IL-8和IL-6水平均明显降低(P<0.05),肝组织α-SMA表达水平显著下降,CCl 4引起的小鼠肝损伤及纤维化程度明显减轻,肝组织TGF-β1、SMAD2 mRNA及蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AF可减轻实验性小鼠肝损伤并改善肝纤维化程度,其作用机制可能与抑制TGF-β1/SMAD通路的激活有密切关系。     

外感清热解毒方抗呼吸道病毒活性的体外实验研究

目的:研究外感清热解毒方体外抗呼吸道病毒的活性。方法:体外培养MDCK、HEL和A549细胞,分别接种流感病毒H1N1、腺病毒AV1和呼吸道合胞病毒RSV1,给予外感清热方进行干预,以病毒唑作为对照。采用MTT法检测药物对细胞的毒性和对病毒的治疗指数,采用红细胞凝集实验和观察细胞病变(CPE)进行分析,研究该方抗呼吸道病毒活性。结果:外感清热方对H1N1的IC 50为0.028 mg/m L,TI为2.07。预防给药在0.01 mg/m L时红细胞凝集实验为阴性,表明该方能够阻断H1N1病毒入侵,有预防作用。治疗给药在0.01 mg/m L时红细胞凝集实验为阴性,表明该方对病毒有治疗作用。直接杀伤实验该方能够降低病毒滴度1个梯度。在0.005 mg/m:时抗AV1红细胞凝集实验为阴性,表明该方能够抑制AV1。镜下观察CPE表明0.01 mg/m L以上浓度的中药能够抑制RSV1。结论:外感清热解毒方具有较好的抗H1N1、AV1和RSV1的活性,具有高效低毒的特点。     

克白颗粒镇静抗疲劳作用研究

目的 观察克白颗粒的镇静抗疲劳作用。方法 小鼠灌胃给予克白颗粒2.26,4.52,9.04 g·kg^-1,观察克白颗粒对小鼠神经系统、游泳时间以及缺氧耐受能力的影响。结果 不同剂量的克白颗粒对小鼠一般行为学及自主活动没有显著影响,9.04 g·kg^-1克白颗粒能显著延长小鼠睡眠潜伏期时间和睡眠时间,并且能延长小鼠的耐缺氧时间(P<0.05),4.52,9.04 g·kg^-1的克白颗粒能显著延长小鼠的游泳时间(P<0.01)。结论 克白颗粒具有一定的镇静和抗疲劳作用。     

米碎花药效微小核糖核酸的鉴定及其靶基因功能分析

目的筛选米碎花Eurya chinensis茎叶的微小核糖核酸(Micro RNAs,mi RNAs)类药效物质及其靶基因功能分析。方法采用高通量测序法,测定米碎花、正常小鼠和喂食米碎花匀浆液小鼠肝组织及血浆中mi RNAs的表达丰度,并与Gene Bank上的植物mi RNAs数据库比对,结合实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)验证,鉴定吸收进入体内的米碎花mi RNAs。以人类m RNA为靶标,采用Target Scan与Mi Randa预测米碎花mi RNAs的靶基因,并通过基因功能聚类(GO)与KEGG分析靶基因的相关功能。结果共鉴定出5个米碎花mi RNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路。结论 mi RNAs可能是一类新型的中药药效物质。     

EB病毒微RNAs在结肠癌中的差异表达及其靶基因的功能预测

目的 筛选结肠癌样本中差异表达的EB病毒微RNAs (microRNAs),并对其靶基因进行功能预测分析.方法 采用Exiqon LNATM microRNA芯片分析结肠癌组织和癌旁组织之间差异表达的内源microRNAs和EB病毒microRNAs.以人类mRNA为靶标,采用3种方法预测EB病毒microRNAs的靶基因,并通过Gene Ontology分析与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes分析预测靶基因的生物学功能.结果 芯片分析得到3个相对于癌旁组织和结肠癌组织表达显著下调的EB病毒microRNAs,生物信息学分析预测其靶基因有329个,其中48个(14.6％)靶基因参与细胞膜组成,86个(26.1％)靶基因在离子结合方面发挥功能,并影响代谢通路、钙离子信号转导、Wnt信号、T细胞受体等多个信号通路.结论 筛选得到3个结肠癌异常表达的EB病毒microRNAs,其靶基因参与信号传导和物质代谢路径,可能影响结肠癌发生发展.     

新橙皮苷二氢查尔酮对流感病毒诱导小鼠肺气血屏障损伤的保护作用

目的 探讨新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）对流感病毒诱导小鼠肺气血屏障损伤的保护作用.方法 建立流感病毒感染小鼠肺炎模型,给予NHDC灌胃治疗.计算小鼠肺指数、湿干比值、肺组织切片HE染色观察其病理形态变化,ELISA法检测感染后第6天血清中IL-6、LTB4和ICAM-1的含量.免疫组化法检测肺组织水通道蛋白5（AQP5）蛋白表达水平.结果 流感病毒感染小鼠肺指数和湿干比值明显升高、肺组织间质炎性细胞渗出,以中性粒细胞浸润为主,伴明显的肺泡充血、水肿,肺组织AQP5蛋白表达水平明显下降;而NHDC可明显逆转上述病理症状.结论 NHDC对流感病毒诱导的小鼠肺组织气血屏障损伤有明显的保护作用,其可能是通过上调AQP5蛋白表达而发挥作用.     

苍术酮对急性肺损伤小鼠保护作用的研究

目的观察苍术酮对急性肺损伤小鼠的保护作用。方法将144只雄性SPF级ICR小鼠分为正常组、模型组、利巴韦林组及苍术酮高、中、低剂量组,除正常组外,其余组均通过呼吸道感染甲型流感病毒诱导小鼠急性肺损伤模型。在造模2 h后,利巴韦林组给予利巴韦林50 mg/kg灌胃,苍术酮低、中、高剂量组分别给予10 mg/kg、20 mg/kg、40mg/kg灌胃,正常组和模型组灌胃等量生理盐水,每天1次,连续5 d。5 d后处死小鼠取出肺组织,计算肺指数,HE染色法观察肺组织病理变化。另取雄性SPF级ICR小鼠120只,按上述实验方法处理,灌胃5 d后继续观察,第15天统计各组小鼠存活情况及存活时间。结果模型组的肺指数明显高于正常组(P0.05),利巴韦林组和苍术酮各组的肺指数均明显低于模型组(P均0.05),且苍术酮高剂量组明显低于苍术酮低剂量组(P0.05);HE染色显示,与模型组比较,各给药组肺组织肺泡明显,细胞相对较完整,炎性渗出减少,肺细胞间隔增厚较轻,细支气管上皮柱状细胞脱落减少。利巴韦林组和苍术酮各组小鼠存活时间显著长于模型组,生存率明显高于模型组,且苍术酮高剂量组存活时间显著长于苍术酮低剂量组,生存率明显高于苍术酮低剂量组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论苍术酮对甲型流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤具有保护作用,可延长存活时间,提高生存率,且呈剂量依赖性,但其作用机制仍需进一步研究。