中药治疗抗精神病药物所致便秘、口干32例疗效观察

中药治疗抗精神病药物所致便秘、口干３２例疗效观察成都市精神病院唐启善，丁波，程鹏方，吴兆雄，罗素兰，周淑琼，高涛，史红，曾国新作者试用中药润燥通秘合剂治疗对３２例抗精神病药物所致便秘、口干患者。其中，男１５例，女１７例。年龄１９～６２岁。（１）药物副...     

5种南海产芋螺粗毒组分对α3β2和α4β2乙酰胆碱受体阻断活性研究

目的 为南海产丰富的芋螺生物资源的深入挖掘和开发利用,为从毒液中发现和寻找新型活性强、选择性好的阻断α4β2 nAChR的芋螺毒素奠定基础。方法 通过对五种南海常见芋螺(豹芋螺、黑芋螺、玉女芋螺、信号芋螺、和帝王芋螺)的毒液进行提取、分段,并采用双电极电压膜片钳技术测定了五种毒液各个组分对α4β2 nAChR和α3β2 nAChR的阻断活性。结果 豹芋螺、黑芋螺、信号芋螺和帝王芋螺这四种芋螺毒液的部分组分表现出较好的α4β2 nAChR阻断活性,同时也对α3β2 nAChR具有一定的阻断作用。豹芋螺大部分组分和黑芋螺毒液Mar-2组分对α4β2 nAChR有明显的阻断作用,阻断率分别高达40 %以上和73.6%,且这些组分未对α3β2 nAChR表现出阻断作用或作用很弱,即对α4β2 nAChR有良好活性且相比于α3β2 nAChR对α4β2 nAChR有较好的选择性。结论 本研究结果为后续对豹芋螺粗毒组分进行活性跟踪的分离纯化,为获得豹芋螺来源的新型芋螺毒素并阐明其结构和功能提供理论依据,为后续寻找选择性阻断α4β2 nAChR的新型芋螺毒素指明了研究方向,为深入开发利用南海产芋螺生物资源奠定了坚实基础。     

α-芋螺毒素LvIA特定氨基酸的突变对其活性的影响

α-芋螺毒素(α-Conotoxin, α-CTx)作为烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)的专一性拮抗剂,是研究nAChRs相关药理和生理功能的重要工具。目的 对特异区分α6/α3β2β3和α3β2两种nAChRs亚型的α-CTx LvIA进行研究,确定影响其活性的关键氨基酸位点。 方法 通过序列比对,两步法氧化折叠、双电极电压钳和圆二色谱等技术确定LvIA中影响其活性的关键氨基酸位点,并探索该位点对LvIA影响的机制。结果 确定了LvIA中第五位组氨酸(His,H)的关键作用,当第五位的His分别被丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)和色氨酸(Trp,W)分别取代后,都会导致LvIA对所有受体亚型的活性丧失。圆二色结果表明该位点的变化对LvIA的二级结构没有显著的影响。结论 第5位His是维持LvIA活性的关键氨基酸残基,该氨基酸极性和侧链的变化均会导致LvIA活性的丧失,但是对其二级结构影响较小。LvIA中第5位氨基酸与nAChR的相互作用力是保证其活性的关键。该结论为基于LvIA设计新型专一作用于乙酰胆碱受体的工具探针改造提供了重要信息。     

海南产芋螺毒素在疼痛与成瘾治疗中的应用前景

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是热带海洋软体动物芋螺分泌的一类用于麻醉猎物的神经毒素肽,是当今国际生物药物研究的热点,被誉为海洋药物宝库,已跃居动物神经毒素研究的首位。其结构新颖,多样性高,活性强,选择性高,能区分各种离子通道的不同亚型,广泛应用于神经药理学的研究、及作为诊断试剂与治疗药物。不同芋螺种类的毒素互不相同,且同一种类不同个体之间的毒素成份及其活性也差异很大,特别是对神经系统疾病有非常重要的研究与诊断治疗作用。在我国,芋螺是海南特有的药用海洋生物资源,其毒素具有特异结合动物体内各种离子通道受体的特殊功能,在镇痛和戒烟戒毒,以及治疗帕金森症、精神病等重大疾病方面具有极好的应用前景。芋螺毒素大多是由7～50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性,以及半胱氨酸模式,分为不同的基因家族,至今,所有已知的芋螺毒素可分为17个超家族,分别为A,C,D,S,M,I1,I2,I3,J,L,O1,O2,O3,P,T,V,Y。按其受体靶位可分为α,ω,μ,δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型,又可分为α,αA,κA(A-超家族),ω,δ,κ,μO(O-超家族),μ,ψ,κM(M-超家族)等家族(亚型)。其中的α-家族类芋螺毒素(α*-CTX)特异阻断哺乳动物的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的离子通道型受体,其介导众多中枢和外周神经系统的生理功能,包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点,这些疾病包括成瘾、疼痛、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChRs激动剂如烟碱,虽然可以缓解上述神经疾病的症状,但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用,且有成瘾性。因此,开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。研究表明,α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合等的新靶点;阻断脊髓神经上的α3β2nAChR,通过抑制C-纤维释放谷氨酸进行疼痛信号的传递,可产生镇痛效应。α9α10 nAChR阻断剂具有治疗神经痛和加速受伤神经恢复的功能。角化细胞上的α9α10 nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用。α9nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达。α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖,该亚基在乳腺癌与肺癌的治疗中具有非常重要的意义。表达在多巴胺能神经元上的α6β2*-nAChRs能被内源乙酰胆碱(Ach)或外源烟碱(尼古丁)及其类似物激活,也就是说,α6β2*-nAChRs的激活在中枢神经系统的胆碱能信息传递通路中起着至关重要的作用,包括运动行为以及药物成瘾的调节。阻断含有α6β2*的nAChRs可有效防止烟瘾、可卡因和吗啡毒瘾的发作,显著抑制吸烟和吸毒的欲望,预示α-芋螺毒素在戒烟、戒毒新药的研发领域具有巨大的潜力。能治疗成瘾的α-芋螺毒素的预期经济和社会效益无可限量。已证实α6/α3β2β3 nAChR是烟碱和其他药物,如可卡因和吗啡等成瘾治疗的新靶点。另外,阻断α3β4 nAChRs可有效减少鸦片与其他刺激物的自身给药欲望和行为。α3β4 nAChR基因敲除的小鼠明显减少烟瘾的发作。因此,α6/α3β2β3与α3β4 nAChRs阻断剂在戒烟戒毒新药的研发领域具有非常重要的价值。我们从海南产芋螺中研究发现了5个特异阻断nAChRs的新颖芋螺毒素及其突变体,分别是αB-CTX VxⅩⅩⅢA,αO-CTX GeⅩⅣA,3个α-CTXs LvⅠA,Txd4和TxIC突变体。其中,αB-CTX VxⅩⅩⅢA来自菖蒲芋螺(Conus vexil-lum),是我们首次发现的一个新超家族芋螺毒素,其半胱氨酸模式和信号肽、以及前肽的组成区域均与以往发现的芋螺毒素完全不同,我们将之定名为B-超家族芋螺毒素,第23种(ⅩⅩⅢ)半胱氨酸模式(4个Cys)的第一个毒素肽。含有40个氨基酸的αB-CTX VxⅩⅩⅢA的前体肽只含有信号肽和成熟肽,而没有其他已知超家族普遍含有的前肽区部分。我们成功合成了αB-CTX VxⅩⅩⅢA的3种可能的异构体,经活性检测发现,αB-CTX VxⅩⅩⅢA是α9α10 nAChR的特异阻断剂。来自将军芋螺(C.generalis)的新芋螺毒素αO-CTX GeⅪⅤA,与O-超家族芋螺毒素前体蛋白信号肽具有很高的同源性,αO-CTX GeⅪⅤA前体由信号肽、前肽和成熟肽3部分组成,推导的含有28个氨基酸的成熟肽含有与J-超家族芋螺毒素相同的半胱氨酸模式。高浓度的αO-CTX GeⅪⅤA既是nAChRs的阻断剂,也是NMDA受体〔N-methyl-D-aspar-tic acid receptor(NMDAR)〕的阻断剂,低浓度的αO-CTX GeⅪⅤA对α9α10 nAChR具有很好的选择性和最强的生物活性,其半阻断剂量(IC50)仅为4.6 nmol·L-1。系统研究了αO-CTX GeⅪⅤA对18个α9α10 nAChR与配体结合界面的关键氨基酸突变型的阻断活性,以及确定结合部位的竞争性试验。3个新的α-芋螺毒素(α-CTX)属于A-超家族芋螺毒素成员,分别是来自疣缟芋螺(Conus lividus)的LvIA,来自织锦芋螺(C.textile)的Txd4与TxIC突变体。它们对相应的nAChRs亚型具有极好的选择性和很强的生物活性。α-CTXLvIA特异阻断α3β4 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为12.5nmol·L-1;α-CTX Txd4特异阻断α6/α3β2β3 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为28 nmol·L-1;α-CTX TxIC突变体特异阻断α3β2 nAChR,其半阻断剂量为14.5 nmol·L-1。这些新的海南产α-家族类芋螺毒素的作用靶点清楚,活性强,选择性高,是开发镇痛和戒烟戒毒等新药的原创先导药物,蕴涵着巨大的经济价值和社会效益。     

α-芋螺毒素TxIB氧化折叠路径研究

目的：阐明TxIB线性肽通过一部氧化法,在体外被氧化折叠形成含有两对二硫键活性肽的具体路径,为后续大量人工合成该活性肽的方法研究提供基础。方法 采用N-9芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法人工合成TxIB线性肽,用高效液相和质谱分析法,监测研究TxIB一步氧化折叠过程中所经历的路径。结果 TxIB氧化路径经历了1对二硫键（1SS）、2对二硫键（X-2SS）折叠中间体后,最终形成稳定的含有2对二硫键（N-2SS）的氧化型TxIB。结论芋螺毒素TxIB折叠路径与前期研究的水蛭素氧化折叠路径一致。     

α3β2与α3β4烟碱型乙酰胆碱受体α和β亚基不同配比的药理活性研究

目的:比较α和β亚基不同配比形成α3β2和α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)敏感性的差异。方法:体外转录获得α和β亚基的cRNA,采用显微注射将3种不同配比(α∶β分别为1∶10、1∶1和10∶1)的cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞,利用双电极电压钳检测受体表达情况。利用激动剂乙酰胆碱(ACh)和拮抗剂α-芋螺毒素Reg IIA(α-CTx Reg IIA)检测在3种配比条件下形成受体药理活性的差异。结果:对于α3β2 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的半数有效浓度(EC50)分别为91.2μmol/L、104.4μmol/L和130.6μmol/L,α-CTx Reg IIA的半数抑制浓度(IC50)分别为40.2 nmol/L、36.4 nmol/L和42.3 nmol/L。对于α3β4 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的EC50分别为44.0μmol/L、110.0μmol/L和230.0μmol/L,α-CTx Reg IIA的IC50分别为226.8 nmol/L、71.5 nmol/L和49.4 nmol/L。结论:α3和β4亚基比例的改变会导致α3β4 nAChR结构和药理活性的改变。α3和β2亚基比例的改变对α3β2 nAChR结构和活性没有影响。     

αB-芋螺毒素VxXXIVA与α9α10乙酰胆碱受体结合特性的研究

αB-芋螺毒素VxXXIVA（αB-VxXXIVA）是我们从海南产菖蒲芋螺（Conus vexillum）中发现的一个新超家族毒素肽,是α9α10乙酰胆碱受体（nAChR）亚型的特异阻断剂。αB-VxXXIVA仅含有简单的4个半胱氨酸模式（C1-C2C3-C4）,其活性最强异构体的二硫键连接方式是Cys1-Cys2和 Cys3-Cys4。存在于外周神经系统中的α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌和肺癌的新靶点,具有很重要的临床意义。具有独特结构的αB-VxXXIVA与α9α10 nAChR之间的结合特性尚不清楚。为此,本文对αB-VxXXIVA与α9α10 nAChR受体之间的结合位点和电压依赖性进行了研究。发现它与具有竞争性结合特性的α-芋螺毒素的结合位点有部分重叠,但又完全不相同,是一个新的微位点,其结合活性随膜电压的升高而不会改变,不具有电压依赖性。该研究结果将为αB- VxXXIVA作为工具药开发、α9α10 nAChR受体结构与功能的研究、以及基于该受体为药靶的药物设计提供理论基础。     

海南产大尉芋螺的新型O-超家族芋螺毒素基因克

目的从海南产大尉芋螺毒液中分离克隆新型O-超家族芋螺毒素基因,为大尉芋螺毒素药物的研究与开发提供源头化合物。方法采用快速扩增cDNA 3’-末端（3’-RACE,Rapid Amplification of cDNA Ends）的方法,对我国海南产大尉芋螺（Conus capitaneus Linnaeus）的毒素cDNA进行分析,克隆测序所得基因片段,再进行序列比较,以及O-超家族芋螺毒素基因的遗传变异分析。结果发现了1种新的O-超家族芋螺毒素cDNA序列CaHr91N,编码长度为77个氨基酸（aa）的前体蛋白CaHr91P,具有典型的芋螺毒素前体结构特征,即由21aa的信号肽、22aa的前肽与34aa的成熟肽三部分组成。毒素区的成熟肽CaHr91M序列为ECREQSQGCTNTsPPccsGLRCSGQSQGGVCISN,具有O-超家族芋螺毒素保守的半胱氨酸框架C-C-CC-C-C．同时比较分析了CaHr91P与其它同源性的O-超家族芋螺毒素的相似性,以及大尉芋螺毒素的研究状况。结论CaHr91P新芋螺毒素基因的发现,及其序列的阐明,为进一步研究其生物活性和应用奠定了基础,同时为更多大尉芋螺毒素的发现和研究利用积累了经验。     

疣缟芋螺毒素的二维液相色谱分离方法

目的建立一种新的基于二维液相色谱技术的疣缟芋螺毒素分离方法,了解其毒素组构成特点。方法从疣缟芋螺毒管中提取芋螺毒素总肽,在传统的凝胶色谱和反相色谱方法的基础上,根据芋螺毒素的等电点和疏水性,利用目标蛋白快速分离系统(Proteome Lab TMPF2D),对其进行二维分离。结果经过传统分离方法,能够检测得到40个左右的芋螺毒素条带,且分离效果不明显。而通过二维液相色谱分离方法,pI/UV图谱显示共检测到约200个芋螺毒素条带。结论同传统分离方法相比,采用Proteome LabTMPF2D系统对毒素分离更快速、分辨率更高,因此更利于鉴定芋螺毒素肽组分,也为下游序列结构特征与生物活性研究奠定了良好的基础。     

海南产桶形芋螺毒管cDNA文库构建

目的构建海南产桶形芋螺毒管cDNA文库,为桶形芋螺毒素基因资源的永续保存和新型药物的研发提供依据。方法以总RNA抽提试剂盒,从桶形芋螺毒管中提取总RNA,采用SMART技术,LD-PCR扩增获得双链cDNA,经SfiⅠ酶切和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,将500bp以上的片段与载体pDNR-LIB连接,通过电穿孔转入E.coli JM109,获得原始文库;随机挑取单菌落,经菌液PCR鉴定重组率及插入片段大小,最后扩增文库。结果经鉴定,所得文库的容量约为5.0×106个克隆,原始文库的平均滴度为5.01×108,插入片段平均长度为1.0kb,文库的重组率达到92%。结论所构建的文库是合格的,为新型芋螺毒素的发现和研究利用提供了依据。