基于张锡纯吐血证治探析老年呕血辨治思路

老年人体质多虚实夹杂,多脏虚损,对于老年呕血患者,若但止血,恐在止血过程中由于瘀血骤然形成,发生危急重症;若但消瘀,又恐正虚难复,再次引发出血,故止血与消瘀当同时进行。但若为急性吐血,吐血量较大,则以止血为第一要务;若吐血量少,反复发作,缠绵难愈,应加用水蛭、土鳖虫、地龙等辛咸之品,此类药物需合用健脾补肾、益气养血之剂,免伤正气。再者,老年患者应尽早扶正,谨防变证。张锡纯治吐血诸方,将消瘀、宁血及补血法寓于止血一法之中,一方多用,止血而不留瘀,补虚而不壅滞,冲、胃、肝、脾、肾往往多向兼顾,药用全面而重点突出,更适用于老年患者。但张锡纯止血之后,无补血专方,应宗唐宗海之意,血止之后予人参养荣汤、大补阴丸等补血方药以善后,同时配合脏腑辨证,补其不足,泻其有余,方可避免反复发作。     

双膦酸盐对破骨细胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

背景：抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞分化及骨吸收功能的特异性标志酶,是破骨细胞分化成熟的标志。目的：观察双膦酸盐对破骨细胞分化及骨吸收功能相关因子抗酒石酸酸性磷酸酶的影响。方法：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导培养破骨细胞。实验分2组：对照组开始时加入质量浓度100μg/L核因子kB受体活化因子配体进行诱导至收获细胞,双膦酸盐组在对照组的基础上加入10-7 mol/L阿仑膦酸盐处理至收获细胞。培养第7天检测各组破骨细胞生成和骨吸收功能,免疫荧光检测两组抗酒石酸酸性磷酸酶表达的差异,Western blot检测抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白表达情况。结果与结论：各组细胞均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞生成,并在牙本质磨片上形成吸收陷窝;但对照组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积均大于双膦酸盐组（P〈0.01）。免疫荧光检测显示,对照组抗酒石酸酸性磷酸酶表达均强于双膦酸盐组（P〈0.01）。Western blot检测显示,双膦酸盐组抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白的表达低于对照组（P〈0.01）。说明双膦酸盐通过抑制抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白的表达,阻碍破骨细胞分化生成及骨吸收功能。     

唑来膦酸对破骨细胞黏附及整合素αv、β3基因表达的影响

目的 研究唑来膦酸（ZOL）对破骨细胞黏附以及整合素α_v和β₃基因表达的影响。方法 体外诱导小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本质吸收陷窝检测以评价破骨细胞生成情况。将细胞分为对照组及ZOL处理组两组,后者用1×10^-6 mol·L^-1的ZOL处理2 d,用结晶紫染色法检测细胞黏附情况,用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和免疫荧光化学法检测整合素α^v、β³ mRNA及蛋白表达水平。结果 TRAP染色及牙本质吸收陷窝检测提示有多核破骨细胞生成。ZOL处理组破骨细胞黏附能力较对照组显著降低（P<0.01）。ZOL处理组整合素α_v、β₃mRNA水平分别为0.66±0.05、0.59±0.08,显著低于对照组的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）;蛋白表达水平分别为31 934.84±112.91、18 812.79±194.13, 较对照组（52 517.81±211.72、31 441.93±456.87）分别下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫荧光化学检测显示,ZOL处理使整合素α_v、β₃荧光强度（9.491±0.748、4.744±0.759）较对照组（15.159±1.143、11.418±1.095）分别降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。结论 ZOL可抑制破骨细胞黏附并下调整合素α_v、β₃表达;ZOL的上述作用可能参与对破骨细胞性骨吸收的抑制。     

唑来膦酸对破骨细胞分化中钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ和Ⅳ基因表达的影响

目的: 研究唑来膦酸(ZOL)对破骨细胞(OC)分化及信号分子钙调蛋白依赖性激酶 (CaMK)Ⅱ、Ⅳ基因表达的影响,阐明其作用机制。 方法: 应用小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7向破骨细胞分化。细胞分为对照组和ZOL组,用核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导5 d,ZOL组同时加用ZOL处理2 d,第5天收集细胞后检测OC生成及CaMKⅡ、CaMKⅣ基因表达情况。 结果: ZOL组中多核OC数、骨吸收陷窝数和面积分别为33.0±1.0、46.0±3.5和(4 125.9±674.8)μm²,明显低于对照组的66.6±3.2、86.0±9.2和(9 418.3±1 260.8)μm²(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,ZOL组细胞中CaMKⅡ和CaMKⅣ基因表达水平明显降低(P<0.05),CaMKⅡ mRNA和蛋白表达水平分别下降了39.3%和58.9％,CAMKⅣ mRNA和蛋白表达水平分别下降了51.7%和46.8％(P<0.01)。免疫荧光化学,与对照组比较,ZOL组细胞中CaMKⅡ、Ⅳ蛋白荧光强度明显下降(P<0.05或P<0.01)。 结论: ZOL在OC多核化阶段可以明显抑制OC的生成和骨吸收功能,并下调CaMKⅡ和CaMKⅣ基因表达。信号分子CaMKⅡ和CaMKⅣ可能参与了唑来膦酸对OC形成和功能的抑制作用,并在该过程中发挥重要的作用。     

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ δ RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的 研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ δ(Ca2+/Calmodulin dependent kinase Ⅱ δ,CaMK Ⅱ δ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用.方法 应用慢病毒构建CaMK Ⅱ δ RNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率.小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组.转染5d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响.结果 成功构建了CaMK Ⅱ δ RNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78％ (P ＜0.05).重组病毒对CaMK Ⅱ δ的干扰效率在mRNA水平超过78％,在蛋白水平超过70％ (P＜0.01).CaMKⅡ δ RNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8％、43.3％和48.5％ (P ＜0.05,P＜0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1％、48.2％和39.6％％(P＜0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果.CaMK Ⅱ δ RNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8％、47.6％和61.3％ (P ＜0.01).结论 CaMKⅡδ RNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;CaMK Ⅱ δ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用.     

唑来膦酸对破骨细胞分化中钙调蛋白､钙调磷酸酶表达的影响

目的:探讨唑来膦酸(zoledronate,ZOL)对破骨细胞分化中钙调蛋白(calmodulin)和钙调磷酸酶(calcineurin)基因表达的影响?方法:小鼠RAW264.7细胞分为A?B两组,均用100 ng/mL核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导4 d;B组细胞在RANKL 诱导第2天加入1×10-6 mol/L ZOL处理48 h?RANKL 诱导4 d后收获细胞,检测破骨细胞生成及calmodulin?calcineurin基因表达情况?结果:B组多核破骨细胞数?吸收陷窝数目及面积分别为(8.8 ± 2.3)个?(6.7 ± 1.2)个和(997.1 ± 14.8)μm2,均显著低于A组的(19.7 ± 2.9)个?(13.3 ± 1.5)个和(1 676.9 ± 24.9) μm2(P < 0.01)?B组calmodulin mRNA及蛋白水平较A组分别降低了51.0%和78.7%(P < 0.05),calcineurin则分别下降了37.0%和69.5%(P < 0.01)?免疫荧光细胞化学显示,B组calmodulin?calcineurin的荧光强度较A组也明显下降?结论:ZOL可显著抑制破骨细胞生成,并下调破骨细胞分化中calmodulin和calcineurin的mRNA和蛋白水平,而calmodulin?calcineurin可能参与了ZOL对破骨细胞形成和功能的抑制?     

WWOX对胰腺癌细胞活性、凋亡及ATP含量影响及机制初步研究

目的研究含WW域的氧化还原酶(WWOX)对胰腺癌细胞增殖活性、凋亡及细胞中三磷酸腺苷(ATP)含量影响。方法在胰腺癌SW1990细胞中转染WWOX过表达质粒,同时转染对照质粒作为阴性组,设置只加入转染试剂的细胞为对照组。荧光定量PCR和Western blot法检测各组胰腺癌细胞中WWOX的表达水平,用MTT法测定胰腺癌细胞增殖活性,用流式细胞术测定胰腺癌细胞凋亡情况,用JC-1法检测胰腺癌细胞线粒体膜电位,用荧光素酶法测定ATP含量,用Western blot法检测胰腺癌细胞线粒体和胞质中细胞色素C(Cyt C)及细胞中剪切型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)、剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果 WWOX过表达质粒转染后的SW1990细胞中WWOX mRNA和蛋白水平高于对照组(P0.05)。高表达WWOX后的SW1990细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中ATP含量降低,线粒体膜电位降低,线粒体中Cyt-C蛋白水平降低,胞质中Cyt-C蛋白水平升高,细胞中Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。阴性组细胞WWOX mRNA和蛋白水平、细胞增殖活性、凋亡率、ATP含量、线粒体膜电位、胞质和线粒体中Cyt-C蛋白水平、细胞中Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白水平与对照组相比均无显著差异(P0.05)。结论 WWOX可以抑制胰腺癌细胞增殖活性,诱导胰腺癌细胞凋亡,减少细胞中ATP合成,这可能与减少线粒体释放Cyt-C和线粒体膜电位有关。     

柴胡皂苷对慢性胆源性胰腺炎大鼠胰腺外分泌功能的影响及机制探讨

目的观察柴胡皂苷(SS)对慢性胆源性胰腺炎(CGP)大鼠胰腺外分泌功能的影响,并探讨其机制。方法选取40只Wistar大鼠建立CGP模型,将建模成功大鼠随机分为模型组、高剂量组和低剂量组,剩余10只健康Wistar大鼠作为对照组(仅游离胆总管末端),高剂量组和低剂量组分别灌胃160 mg/kg、80 mg/kg SS溶液,对照组和模型组灌胃生理盐水溶液,每天1次,连续5 d。对比各组灌胃后第1、3、5天血清淀粉酶、胆红素水平,对比灌胃前和灌胃第1、3、5天粪弹性蛋白酶-1(FE-1)水平;末次灌胃6 h后进行胰泌素(CCK)试验并进行组织形态学观察,对比3组大鼠胰液分泌量、胰液蛋白及HCO3-水平;并对比大鼠胰腺组织中即刻早期基因(c-fos、c-jun)mRNA及蛋白相对表达量。结果经血清生化检验及HE染色检验,确认30只大鼠建模成功,灌胃后模型组胰腺纤维组织增生加重,低剂量组纤维组织减少;高剂量组纤维组织明显较少。灌胃后大鼠血清淀粉酶、胆红素组间比较,对照组最低、高剂量组其次、低剂量组稍高、模型组最高,且每两组间比较差异均显著(P0.05),灌胃后高、低剂量组随时间延长呈显著降低趋势(P0.05),模型组随时间延长呈显著升高趋势(P0.05);灌胃前低、高剂量组和模型组FE-1水平均显著低于对照组(P0.05),灌胃后FE-1水平组间比较,对照组最高、高剂量组其次、低剂量组稍低、模型组最低,且每两组间比较差异有显著性(P0.05);灌胃后高、低剂量组随时间延长呈显著升高趋势(P0.05),模型组随时间延长呈显著降低趋势(P0.05);对照组血清淀粉酶、胆红素、FE-1水平随时间延长变化不显著(P0.05);注射后CCK后大鼠胰液分泌量、胰液蛋白及HCO_3~-水平均显著高于基础值(P0.05),注射前、后上述指标比较,对照组最高、高剂量组其次、低剂量稍低、模型组最低,每两组间比较差异均显著(P0.05);胰腺组织中c-fos、c-jun mRNA及蛋白相对表达量组间比较,对照组最低、高剂量组其次、低剂量组稍高、模型组最高,且每两组间比较差异均显著(P0.05)。结论 SS可显著改善CGP大鼠的胰腺外分泌功能,可能与c-fos、c-jun mRNA及蛋白表达抑制有关。     

沉默干扰素调控因子2降低胰腺癌细胞有氧糖酵解水平的实验研究

目的:研究干扰素调控因子2（interferon regulatory factor 2,IRF-2）对胰腺癌细胞有氧糖酵解水平的影响。方法:胰腺癌细胞感染含有IRF-2-shRNA的慢病毒及对照空载体病毒记为干扰组和阴性组，以不做处理的细胞作为对照组，用Realtime PCR和Western blot方法测定细胞中IRF-2水平，MTT方法测定胰腺癌细胞的增殖情况，Western blot方法测定细胞内糖酵解关键酶己糖激酶2（HK2）、丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）蛋白、NF-κBp65（NF-κBp65亚型）、细胞核增殖抗原(Ki-67)表达水平，用试剂盒检测细胞乳酸生成及葡萄糖消耗水平，同时检测细胞中三磷酸腺苷（ATP）合成水平。结果:干扰组细胞中的IRF-2 mRNA和蛋白水平均明显低于对照组，而阴性组细胞中IRF-2 mRNA和蛋白水平与对照组比较没有明显差异。干扰组细胞的OD值明显降低，细胞中HK2、PKM2、NF-κBp65、Ki-67蛋白水平降低，同时细胞乳酸生成及葡萄糖消耗量均降低，细胞合成的ATP减少，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性组细胞OD值、HK2蛋白水平、PKM2蛋白水平、Ki-67蛋白水平、NF-κBp65蛋白水平、乳酸生成、葡萄糖消耗量、ATP水平与对照组相比，差异均没有统计学意义（P＞0.05）。结论:沉默IRF-2抑制胰腺癌细胞中糖酵解关键酶表达，降低细胞糖酵解水平，抑制胰腺癌细胞增殖。