下调GABA受体基因对癫痫模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响及作用机制

目的 探讨下调GABA受体基因对癫痫模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响及作用机制。方法 选择30只SD健康雄性大鼠,建立癫痫模型,建模成功后分为模型组、上调组、下调组各10只; 进行细胞转染建立稳定转染的GABA上调组、GABA下调组; 检测3组大鼠海马神经细胞凋亡及PI3K、AKt、mTOR、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。结果 上调组大鼠各时间点海马神经细胞凋亡率高于模型组(P<0.05); 下调组大鼠各时间点海马神经细胞凋亡率低于模型组(P<0.05); 下调组大鼠各时间点海马神经细胞凋亡率低于上调组(P<0.05)。上调组大鼠各时间点海马神经细胞增殖率、Bcl-2、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达水平均低于模型组,而Bax、Caspase-3蛋白表达水平高于模型组(P<0.05); 下调组大鼠各时间点海马神经细胞增殖率、Bcl-2、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达水平均高于模型组,而Bax、Caspase-3蛋白表达水平低于模型组(P<0.05); 下调组大鼠各时间点海马神经细胞增值率、Bcl-2、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达水平均高于上调组,而Bax、Caspase-3蛋白表达水平低于上调组(P<0.05)。结论 下调GABA受体基因可能是通过调节PI3K/AKt/mTOR来作用于下游凋亡靶基因,最终抑制癫痫模型大鼠海马神经细胞凋亡     

乙酰谷酰胺对脑外伤小鼠脑水肿程度及Omi/HtrA2信号通路的影响

目的 探讨乙酰谷酰胺对脑外伤小鼠脑水肿程度及Omi/HtrA2信号通路的影响。方法 应用C57BL/6小鼠进行实验,随机分为治疗组、模型组和假手术组,每组10只小鼠; 模型组和治疗组小鼠麻醉后选择中线旁开2 mm处和右侧冠状缝后1 mm作为撞击点,将其头皮切开,钻1个5 mm直径的骨孔,应用Feeney自由落体损伤装置,找25 cm处应用40 g重击锤自由落体撞击,打击深度为5 mm,将鼠皮缝合; 假手术组小鼠仅将其头皮切开,并不进行自由落体击打; 造模30 min后治疗组小鼠腹腔注射乙酰谷酰胺,其余2组大鼠注射1 mL生理盐水,连续治疗3 d; 第3 d小鼠深度麻醉后断头处死,并将小鼠的海马组织和大脑组织进行分离; 对受损侧大脑组织含水量进行检测; 对各组小鼠的海马组织的细胞凋亡情况进行检测; 应用免疫印迹(Western blot,WB)对小鼠海马组织中的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Polyadenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、前体半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Precursor caspase 9,Pro-caspase-9),Pro-caspase-3,X染色体连锁的调亡抑制蛋白(X-linked apoptosis suppressor protein,XIAP)以及Omi/TtrA2蛋白水平进行检测; 应用四肽荧光底物法对海马组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白活性进行检测。结果 小鼠颅脑损伤后损伤侧脑组织的含水量明显升高; 与模型组的(82.34±0.28%)比较,治疗组的脑组织含水量(78.28±0.78%)有所降低(P<0.05); 假手术组的脑组织含水量为(77.37±0.49%),与治疗组的脑组织含水量相当(P>0.05); 模型组的海马神经元凋亡率明显高于假手术组(P<0.05),治疗组小鼠的海马神经元凋亡率要低于模型组(P<0.05); 模型组海马组织PARP,Pro-caspase-9,Pro-caspase-3以及Omi/TtrA2水平较假手术组高(P<0.05),模型组海马组织的XIAP蛋白水平相对于假手术组有所降低(P<0.05); 治疗组小鼠海马组织PARP,Pro-caspase-9,Pro-caspase-3以及Omi/TtrA2水平相对于模型组有所降低,XIAP蛋白水平有所升高(P<0.05); 模型组海马组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Cysteine containing aspartate-specific proteases-9,Caspase-9)和Caspase-3蛋白活性相对于假手术组有所升高(P<0.05); 治疗组海马组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白活性相对于模型组有所降低(P<0.05)。结论 乙酰谷酰胺能够有效降低脑外伤小鼠的脑水肿情况,并且能够通过影响Omi/HtrA2信号通路来减少神经元的凋亡。     

胰高血糖素样肽1(GLP-1)改善阿尔茨海默病大鼠模型的认知功能及其机制研究

目的 探讨胰高血糖素样肽1(GLP-1)改善阿尔茨海默病大鼠认知功能的机制。方法 以正常成年雄性SD大鼠为研究对象,将其随机分为正常对照组、AD模型组、AD模型+GLP-1干预组和AD模型+PPARγ抑制剂+GLP-1干预组; 其中AD模型组以侧脑室注射STZ(3 mg/kg,10 μL)制造AD模型,AD模型+GLP-1干预组在AD造模基础上每日腹腔注射利拉鲁肽(200 μg/kg,10 μL),连续给药28 d,AD模型+PPARγ抑制剂+GLP-1干预组在AD造模基础上侧脑室注射PPARγ抑制剂GW9662(2.5 nmol/g,10 μL),随后腹腔注射利拉鲁肽(200 μg/kg,10 μL)并连续给药28 d; 观察4组大鼠在Morris水迷宫中的学习和记忆能力变化; ELISA方法观察各组大鼠海马Aβ42的水平; Western blot观察各组大鼠海马PPARγ蛋白表达水平。结果 与AD模型组比较,GLP-1干预后的AD大鼠在Morris水迷宫中学习和记忆能力明显改善,海马Aβ42的水平显著降低,海马PPARγ蛋白表达水平显著升高(P<0.05); 与AD模型+GLP-1干预组比较,AD模型+PPARγ抑制剂+GLP-1干预组大鼠海马PPARγ蛋白表达水平显著降低,在Morris水迷宫中学习和记忆能力明显下降,海马Aβ42的水平显著增高(P<0.05)。结论 GLP-1可能通过激活PPARγ抑制Aβ 蓄积,从而起到改善阿尔茨海默病的认知功能作用。     

脑出血大鼠颅内溶血磷脂酸受体1与血肿周围 水肿区细胞凋亡的相关性研究

目的 研究脑出血大鼠颅内溶血磷脂酸受体1(LPA-1)与血肿周围水肿区细胞凋亡的相关性。方法 选取134例Wistar大鼠,随机分为正常组和脑出血组,正常组60例,脑出血组74例,脑出血组大鼠采用立体定向脑内注入法构建脑出血模型; 采用RT-PCR检测LPA-1、Caspase-3表达水平,采用双盲法测定神经功能评分,采用Western blot检测Bax蛋白、Bcl-x蛋白表达水平,采用流式细胞术检测各种细胞水平及细胞凋亡水平,根据Pearson相关性分析法大鼠颅内溶血磷脂酸受体1(LPA-1)、Bax蛋白、Bcl-x蛋白及细胞凋亡的相关性。结果 脑出血组LPA-1、Caspase-3表达水平均明显高于正常组(P<0.05); 脑出血组神经功能评分明显高于正常组(P<0.05); 脑出血组Bax蛋白表达水平显著高于正常组,脑出血组Bcl-x蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.05); 脑出血组LPA-1、Caspase-3、Bax蛋白表达水平及神经功能评分持续升高,Bcl-x蛋白表达持续降低,直到第3 d到达顶峰后缓慢恢复,到第7 d恢复到正常评分的80%左右。脑出血组中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、细胞凋亡率均明显高于正常组(P<0.05); 脑出血组性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、细胞凋亡率持续升高,直到第3 d到达顶峰后缓慢降低,到第7 d降低更加显著。LPA-1与Bax蛋白的表达水平呈正相关(r=0.33,P<0.05); LPA-1与Bcl-x蛋白的表达水平呈负相关(r=0.25,P<0.05); LPA-1表达水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.81,P<0.05); Bax蛋白与Bcl-x蛋白的表达水平呈负相关(r=-0.22,P<0.05); Bax蛋白表达水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.71,P<0.05); Bcl-x蛋白表达水平与细胞凋亡率呈负相关(r=0.74,P<0.05)。结论 LPA-1与Caspase-3在大鼠脑出血中高表达,神经功能评分在大鼠脑出血中评分过高,Bax蛋白在大鼠脑出血中高表达,Bcl-x蛋白在大鼠脑出血中低表达,脑出血大鼠细胞凋亡率过高,LPA-1、Bax蛋白、Bcl-x蛋白及细胞凋亡在大鼠脑出血中关系密切,可能具有相关性。     

深低温对全脑缺血大鼠海马线粒体细胞色素C释放及细胞凋亡影响

目的 观察深低温对全脑缺血大鼠海马线粒体细胞色素C(Cyt-C)释放和细胞凋亡的影响,探讨深低温的脑保护作用机制. 方法 24只SD大鼠建立大鼠体外循环模型后按随机数字表法分成3组:对照组(建立大鼠体外循环模型5 min后迅速处死取海马组织)、常温缺血组[大鼠于(37±0.3)℃下停循环5 min后迅速处死取海马组织)和低温缺血组(热交换器配合体外冰屑诱导使大鼠肛温降至(18±0.5)℃,停循环5 min后迅速处死取海马组织),每组各8只.Western blotting检测3组大鼠海马神经细胞胞浆Cyt-C的表达,TUNEL法检测3组大鼠海马神经细胞凋亡率. 结果 常温缺血组海马神经细胞胞浆Cyt-C浓度(3.57±0.82)较对照组(0.48±0.14)明显升高,而低温缺血组Cyt-C浓度(1.24±0.53)较常温缺血组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).常温缺血组海马神经细胞凋亡率(50.45％±3.71％)较对照组(2.56％±0.43％)明显升高,而低温缺血组海马神经细胞凋亡率(16.51％±2.65％)较常温缺血组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 深低温可抑制全脑缺血大鼠海马线粒体Cyt-C释放和细胞凋亡,是其脑保护作用的重要机制之一.     

VitB12及叶酸对伴高同型半胱氨酸血症的AD患者血清神经递质、细胞因子水平及认知功能的影响

目的 探讨VitB12及叶酸对伴高同型半胱氨酸血症的阿尔茨海默病(AD)患者血清神经递质、细胞因子水平及认知功能的影响。方法 选取2018年2月-2019年2月在本院收治的伴高同型半胱氨酸血症的AD患者90例为研究对象,并将其随机分为2组,即对照组和研究组,各45例; 对照组采用盐酸多奈哌齐+盐酸美金刚进行治疗,研究组采用VitB12+叶酸+盐酸多奈哌齐+盐酸美金刚治疗; 比较2组患者治疗后的血清神经递质、细胞因子水平以及认知功能。结果 2组治疗前血清IFN-r、IL-6、VEGF、BDNF水平比较无明显差异(P>0.05); 2组治疗后血清IL-6、IFN-r、Hcy水平与治疗前比较明显降低(P<0.05),且组间比较有明显差异(P<0.05); 研究组治疗6个月后Hcy水平较治疗前明显降低(P<0.05),而对照组则治疗前后无明显变化(P>0.05),2组治疗6个月后Hcy水平比较,有明显差异(P<0.05)。2组治疗后血清BDNF和VEGF水平与治疗前比较明显升高(P<0.05),且组间比较也有明显差异(P<0.05)。2组治疗前血清5-HT、β-EP、DA水平比较无明显差异(P>0.05); 2组治疗后血清5-HT、β-EP、DA水平与治疗前比较明显升高(P<0.05),且组间比较有明显差异(P<0.05)。治疗6个月后研究组的认知功能评分明显高于对照组(P<0.05)。结论 采用VitB12结合叶酸可以降低伴高同型半胱氨酸血症的AD患者的同型半胱氨酸水平,并且还可有效改善患者血清神经递质、细胞因子水平以及认知功能。     

mTOR信号通路在左旋多巴诱发异动症中的作用及机制研究

目的 探讨mTOR(Mammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路的激活在左旋多巴诱发异动症(L-Dopa Induced Dyskinesia,LID)大鼠纹状体中的作用及机制。方法 普通级SD雄性大鼠共54只,随机分为5组,8只正常组(N组),剩下8只帕金森病(Parkinson’s disease)模型; 异动症组10只、余均分为雷帕霉素(Rapamycin)作为药物治疗组即干预组和Rapamycin溶剂的对照组(C组)各14只; 记录下对照组与干预组的行为学并进行异动症AIM评分,每周至少两次; 用western blot技术测定N组、PD组、LID、C组以及R组纹状体组织的免疫印迹,验证所用NMDA受体亚基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位点磷酸化及PSD-95、p-PSD95(S295)磷酸化位点的抗体特异性的变化。结果(1)对照组第1,3,5天时间点行为学AIM评分与干预组无差异(P>0.05),第8天时间点行为学AIM评分与对照组比较,干预组AIM评分有下降(P<0.01),之后第9、10、13、16、18、21天2组仍然有明显差异,干预组AIM评分无反弹上升现象。(2)LID组大鼠纹状体PSD-95及p-PSD95(s295)表达水平较其他组高; 干预后两者的表达水平明显下降(P<0.05)。PSD-95及p-PSD95(S295)在正常组表达水平最低,在异动症组和对照组最高,无差异(P>0.05); 与正常组外其他组对比,干预组两者的表达水平明显下降(P<0.05); 干预组与正常组的表达水平无明显差异(P>0.05)。(3)LID组、对照组NMDA受体亚基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位点磷酸化的表达水平较干预组有所增高(P均<0.05)。结论(1)mTOR参与了LID的发病,应用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素对LID的治疗有效。(2)大鼠纹状体区的mTOR信号调理与LID的发生密切相关,mTOR激活对纹状体突触水平具有调节作用,可能通过依赖突触分子PSD-95以及NMDAR各亚型的磷酸化水平导致突触可塑性发生适应改变,最终产生和维持皮质纹状体突触“病理性LTP”,从而介导了LID发生。     

κ阿片受体激动剂（U50488H）对缺血性脑卒中大鼠神经元自噬、迟发性神经元损伤及NOTCH表达水平的影响

目的 探讨κ阿片受体激动剂(U50488H)对缺血性脑卒中大鼠神经元自噬、迟发性神经元损伤及NOTCH表达水平的影响。方法 选取40只清洁级(Specific pathogen free,SPF)级Sprague Dawley(SD)雄性大鼠,随机分为正常(N)组、模型(M)组、丁苯酞(B)组、U50488H(U)组,每组各10只,对M,B,U组采用线栓法建立缺血性脑卒中模型,N组不建立该模型,建模成功后对B组给予灌胃4.5 mg/kg的丁苯酞,对U组给予脑内注射1.5 mg/kg的U50488H,N,M组同期给予灌胃同体积生理盐水,生物机能实验系统检测大鼠脑血流动力学,Zea longa评分及神经症状评分(Neurosymptom score,NSS)评分检测大鼠迟发性神经损伤,HE染色法检测脑组织病理形态,免疫印迹法检测脑组织中自噬相关蛋白表达水平,免疫组化法检测NOTCH表达水平。结果 与N组比较,M组心率(Heart rate,HR)、收缩压(Systolic blood pressure,SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)均显著升高(P<0.05); 与M组比较,B,U组大鼠HR,SBP,DBP均显著降低(P<0.05),且U组比B组降低显著(P<0.05)。与N组比较,M组Zea longa评分、NSS评分均显著升高(P<0.05); 与M组比较,B,U组大鼠Zea longa评分、NSS评分均显著降低(P<0.05),且U组比B组降低显著(P<0.05)。N组大鼠脑组织及皮质结构完整且致密均匀,神经细胞核形态正常完整,核仁清晰,神经细胞排列整齐,未见细胞周围间隙水肿; M组脑组织结构遭到破坏,细胞排列紊乱且着色变浅,核仁及结构消失,出现蹄网状结构,并可见大量空泡; 与M组比较,B,U组病理状态明显,细胞体积明显缩小,细胞排列少且散乱。与N组比较,M组脑组织中LC3,Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05); 与M组比较,B,U组脑组织中LC3,Beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且U组比B组降低显著(P<0.05)。与N组比较,M组脑组织NOTCH蛋白表达水平显著升高(P<0.05); 与M组比较,B,U组脑组织NOTCH蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且U组比B组降低显著(P<0.05)。结论 κ阿片受体激动剂可显著降低缺血性脑卒中大鼠神经元自噬及NOTCH表达水平,并有效改善迟发性神经元损伤。     

地黄多糖调控环状RNA0010729/miR-326通路对海马神经元缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨地黄多糖对海马神经元缺氧复氧损伤的影响及其保护机制是否与调控环状RNA 0010729(circ_0010729)和微小RNA-326(microRNA-326,miR-326)表达有关。方法 体外培养大鼠海马神经元建立缺氧复氧损伤模型; 将大鼠海马神经元分为对照组、模型组、模型+地黄多糖低剂量组、模型+地黄多糖中剂量组、模型+地黄多糖高剂量组、模型+小干扰RNA阴性对照(Small interfering RNA negative control,si-NC)组、模型+si-circ_0010729组、模型+地黄多糖高剂量+空载质粒(Empty plasmid,pcDNA)组、模型+地黄多糖高剂量+pcDNA-circ_0010729组; 流式细胞术检测细胞凋亡; 试剂盒检测丙二醛(Malonaldehyde,MDA)水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性; 实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测circ_0010729,miR-326表达水平; 荧光素酶报告实验确定circ_0010729和miR-326靶向关系。结果 与对照组比较,模型组细胞凋亡率、MDA水平、circ_0010729表达水平升高(P<0.05),SOD活性、miR-326表达水平降低(P<0.05); 与模型组比较,模型+地黄多糖低剂量组、模型+地黄多糖中剂量组、模型+地黄多糖高剂量组细胞凋亡率、MDA水平、circ_0010729表达水平降低(P<0.05),SOD活性、miR-326表达水平升高(P<0.05); 与模型+si-NC组比较,模型+si-circ_0010729组细胞凋亡率、MDA水平降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05); 与模型+地黄多糖高剂量+pcDNA组比较,模型+地黄多糖高剂量+pcDNA-circ_0010729组细胞凋亡率、MDA水平升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05)。结论 地黄多糖能够有效抑制缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元凋亡和氧化损伤,其机制可能与抑制circ_0010729/miR-326通路有关。     

银杏叶提取物对脑动脉粥样硬化大鼠血清TG、TC和HO-1水平的影响

目的 探讨银杏叶提取物对脑动脉粥样硬化大鼠血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)和血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)水平的影响。方法 30只SD健康雄性大鼠,20只大鼠建立老龄脑动脉粥样硬化模型,分为假手术组、模型组和银杏叶组; 检测血清TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、HO-1水平、动脉硬化指数(Arteriosclerosis index,AI); 采用MTT检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测脑动脉平滑肌细胞凋亡,Western blot法检测Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平。结果 与模型组比较,银杏叶组脑动脉斑块面积、新生内膜面积、内膜厚度降低,管腔面积升高(P<0.05); 与模型组比较,银杏叶组TG、HDL-C水平、AI降低,TC、HO-1水平升高(P<0.05); 与模型组比较,银杏叶组24、48、72 h细胞凋亡率降低(P<0.05),银杏叶组24 h细胞凋亡率低于48和72 h细胞凋亡率(P<0.05); 与模型组比较,银杏叶组48、72 h细胞增殖率升高(P<0.05),银杏叶组24h细胞增殖率低于48和72 h细胞增殖率(P<0.05); 与模型组比较,银杏叶组Caspase-3、Bax水平降低,Bcl-2水平升高(P<0.05)。结论 银杏叶提取物能够改善脑动脉粥样硬化大鼠血清TG、TC、HO-1水平,并通过下调Caspase-3、Bax蛋白表达,上调Bcl-2表达来促进脑动脉平滑肌细胞增殖,抑制脑动脉平滑肌细胞凋亡。     

基于PI3K/Akt通路研究右美托咪定对癫痫持续状态大鼠海马神经元自噬的调节作用

目的 探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)对癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)大鼠海马神经元自噬的调节作用及对磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法 采用戊四氮(PTZ)点燃制备SE大鼠模型,随机分为模型组(M组)、Dex低剂量(Dex-L)组、Dex高剂量(Dex-H)组、Dex-H +LY294002(Dex-H+LY)组,另取正常SD大鼠为对照组(NC组),每组各15只; Dex-L组、Dex-H组分别腹腔注射Dex 25、100 μg/kg; Dex-H+LY组脑室注射5 μL PI3K抑制剂LY294002+腹腔注射Dex 100 μg/kg,NC组、M组大鼠腹腔注射等量生理盐水; 观察大鼠行为学表现并进行脑电图描记; 原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠海马神经元凋亡情况; 免疫印迹(WB)检测各组大鼠海马组织中LC3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果 NC组大鼠脑电图无异常放电现象,主要以α、β波为主; M组大鼠出现大量阵发性棘波、高幅尖波、棘慢复合波、尖慢复合波等; Dex-L组、Dex-M组大鼠癫痫发作减少或波幅降低; Dex-H+LY组大鼠癫痫样放电较Dex-H组明显增加。与NC组比较,M组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加,海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与M组比较,Dex-L组、Dex-H组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达依次减少(P<0.05),海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平依次增高(P<0.05); 与Dex-H组比较,Dex-H+LY组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加,海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 Dex可能通过促进PI3K/Akt信号通路激活来抑制SE大鼠海马神经元过度自噬,减轻神经元凋亡,发挥抗惊厥及脑保护作用。     

厄贝沙坦对Alzheimer病大鼠海马Tau蛋白磷酸化的影响

目的研究厄贝沙坦对Alzheimer病(AD)大鼠海马Tau蛋白磷酸化的影响。方法侧脑室注射寡聚体形式的β淀粉样蛋白(Aβ)1-42制作AD大鼠模型;自术前1周至术后2周(手术当天暂停给药1次),厄贝沙坦干预组给予厄贝沙坦30mg/(kg.d)灌胃,AD模型组给予等量生理盐水灌胃。用Morris水迷宫试验检测学习记忆能力,Westernblot法检测海马Tau蛋白及其丝氨酸199/202位点、396位点磷酸化水平;分析软件测定Westernblot图像条带光密度(OD)值。并与正常对照组和假手术组比较。结果AD模型组Morris水迷宫试验逃避潜伏期比正常对照组和假手术组长(均P<0.05),厄贝沙坦干预组与正常对照组和假手术组差异无统计学意义。4组间海马Tau蛋白总量差异无统计学意义;与AD模型组比较,厄贝沙坦干预组丝氨酸199/202和396位点磷酸化Tau蛋白水平明显降低(均P<0.05);而与正常对照组和假手术组差异无统计学意义。结论厄贝沙坦能减轻AD大鼠海马Tau蛋白磷酸化水平。     

当归含药血清通过调控miR-129表达对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用

目的 探讨当归含药血清通过调控微小RNA-129(MicroRNA-129,miR-129)表达对阿尔茨海默病PC12细胞的保护作用。方法 分别以1.5 g/kg当归药液及等量生理盐水对SD(Sprague Dawley)大鼠灌胃处理,配制成10%含药血清及正常血清培养液; 将PC12细胞分为空白组、模型组、药物组、药物+Control小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)组、药物+miR-129 siRNA组,除空白组外,其余各组均用30 μL的Aβ_25-35溶液诱导细胞损伤24 h构建阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型,空白组及模型组用空白血清培养液培养,其余各组用10%含药血清培养液培养,培养48 h后收集各组细胞观察细胞形态学; 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测其中miR-129表达水平,采用甲基噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测各组细胞的增殖抑制率; 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡及周期情况; 蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测细胞凋亡相关因子蛋白的表达水平; 酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunoSorbent assay,ELISA)试剂盒检测乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(T-superoxide dismutase,T-SOD)水平。结果 与空白组比较,模型组PC12细胞贴壁功能受损,miR-129、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白水平、S期及G2/M期细胞数目、T-SOD水平降低(P<0.05),细胞抑制率、凋亡率、半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),G0/G1期细胞数目、LDH,MDA水平升高(P<0.05); 与模型组比较,药物组细胞贴壁功能改善,miR-129,Bcl-2蛋白水平、S期及G2/M期细胞数目、T-SOD水平升高(P<0.05),细胞抑制率、凋亡率、Caspase-3,Bax,G0/G1期细胞数目、LDH,MDA水平下降(P<0.05); 与药物组、药物+Control siRNA组比较,细胞贴壁功能受损,miR-129,Bcl-2蛋白水平、S期及G2/M期细胞数目、T-SOD水平降低(P<0.05),细胞抑制率、凋亡率、Caspase-3,Bax,G0/G1期细胞数目、LDH,MDA水平升高(P<0.05)。结论 当归含药血清对于阿尔茨海默病细胞模型具有一定的保护作用,其机制可能与上调miR-129表达有一定关系。     

巴豆生物碱通过ERK1/2通路对脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤及自噬的影响

目的 探讨巴豆生物碱(Croton alkaloids,CA)通过细胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)通路对脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤及自噬的影响。方法 50只大鼠建立大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,造模成功大鼠(48只),并随机分为模型组(12只)、CA低剂量组(12只)、CA中剂量组(12只)和CA高剂量组(12只),其余10只为对照组; CA低、中和高剂量组分别注射0.6、1.2、2.4 mg/kg的CA注射液,连续注射7 d; 对照组及模型组给予等量生理盐水注射; 应用神经功能评分法评定大鼠神经功能缺损和改善情况; 苏木精-伊红染色法(Hematoxylin eosin staining,HE)检测大鼠脑组织海马神经元的形态及数量; 原位末端转移酶标记法(Terminal uridine nick end labeling,TUNEL)检测大鼠脑组织细胞凋亡; 实时荧光定量聚合酶链反应(Real time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠海马ERK1/2、哺乳动物同源蛋白(Mammalian homologous protein,Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3-Ⅱ)mRNA和蛋白表达水平。结果 与模型组比较,CA低、中、高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05); 与CA低剂量组比较,CA中、高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05); 与CA中剂量组比较,CA高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论 CA可降低MCAO大鼠神经细胞凋亡率,在一定程度上修复MCAO大鼠神经功能,发挥神经保护作用,其机制可能与激活ERK1/2信号通路有关。     

天麻素注射液对蛛网膜下腔出血大鼠NF-κB/Bax/Caspase-3通路及神经元凋亡的影响

目的 探讨天麻素注射液对蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)大鼠核转录因子-κB/B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Nuclear factor-κB,NF-κB/B cell lymphoma-2 associated X protein,Bax/Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)通路及神经元凋亡的影响。方法 血管穿刺法建立SAH大鼠模型,模型成功50只,随机分为模型组、天麻素低、中、高剂量组(腹腔注射5、10、20 mg·kg^-1·d^-1天麻素注射液)、阳性对照组(腹腔注射0.5 mg·kg^-1·d^-1地塞米松磷酸钠注射液),每组各10只,另10只大鼠设为假手术组; 干预3周后测定大鼠神经功能评分; 流式细胞术检测脑皮层细胞凋亡情况; 原位末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)检测神经元凋亡状态; 蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测大鼠脑皮层NF-κB,Bax,Caspase-3、生长相关蛋白-43(Growth-associated protein-43,GAP-43)、突触素(Synaptophysin,SYN)蛋白表达水平。结果 与假手术组比较,模型组神经功能评分、脑皮层神经元凋亡率、脑组织中NF-κB,Bax,Caspase-3蛋白表达水平升高,脑皮层组织中GAP-43,SYN蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,天麻素中、高剂量组、阳性对照组神经功能评分、脑皮层神经元凋亡率、脑组织中NF-κB,Bax,Caspase-3蛋白表达水平降低,脑皮层组织中GAP-43,SYN蛋白表达水平升高(P<0.05); 天麻素低剂量组脑皮层神经元凋亡率、脑组织中NF-κB,Bax,Caspase-3蛋白表达水平降低,脑皮层组织中GAP-43,SYN蛋白表达水平升高(P<0.05); 随着天麻素注射液剂量的升高,神经功能评分、脑皮层神经元凋亡率、脑组织中NF-κB,Bax,Caspase-3蛋白表达水平降低,脑皮层组织中GAP-43,SYN蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论 天麻素注射液可能通过抑制NF-κB/Bax/Caspase-3通路来实现对神经元凋亡的缓解和对SAH大鼠的脑保护。     

Fas基因沉默对帕金森病大鼠脑纹状体多巴胺能神经元凋亡的影响及机制研究

目的 探讨脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,Fas)基因沉默对帕金森病大鼠脑纹状体多巴胺能神经元凋亡的影响及机制。方法 取40只大鼠,30只大鼠脑纹状体注射4 μL 6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine Hydrobromide,6-OHDA)建立帕金森病大鼠模型,剩余10只为假手术组,脑纹状体注射等量2 g/L抗坏血酸的生理盐水; 取建模成功的27只大鼠并随机分为模型组、阴性对照组和沉默组,每组各9只; 阴性对照组和沉默组分别向大鼠纹状体内注射3 μL含无义序列的短片断干扰RNA(Small interfer RNA,siRNA)和Fas siRNA,模型组和假手术组分别向大鼠纹状体内注射等量生理盐水; 干预1周后实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot检测大鼠纹状体多巴胺能神经元Fas mRNA和蛋白相对表达水平,苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色观察大鼠纹状体多巴胺能神经元损伤情况,原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL)染色检测大鼠纹状体多巴胺能神经元凋亡,RT-qPCR,Western blot检测纹状体多巴胺能神经元Fas配体(Fas Ligand,Fasl)、Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associateddeathdomain,FADD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Cysteine containing aspartate-specific proteases-8,Caspase-8)mRNA、蛋白相对表达水平。结果 与假手术组比较,模型组、阴性对照组和沉默组Fas mRNA和蛋白相对表达水平升高(P<0.05); 与模型组和阴性对照组比较,沉默组Fas mRNA和蛋白相对表达水平降低(P<0.05); HE染色显示,Fas基因沉默后神经元排列紊乱程度及胞质肿胀程度减轻,间质较为清晰,空泡皱缩坏死减少; 与假手术组比较,模型组、阴性对照组和沉默组神经元凋亡率升高(P<0.05); 与模型组和阴性对照组比较,沉默组神经元凋亡率降低(P<0.05); 与假手术组比较,模型组、阴性对照组和沉默组Fasl,FADD,Caspase-8 mRNA及蛋白相对表达水平升高(P<0.05); 与模型组比较,沉默组Fasl,FADD,Caspase-8 mRNA及蛋白相对表达水平降低(P<0.05)。结论 Fas基因沉默能抑制帕金森病大鼠脑纹状体多巴胺能神经元凋亡,且可能通过下调Fas,Fasl,FADD,Caspase-8 mRNA及蛋白表达水平来发挥调控作用。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨白芍总苷对多发性硬化模型大鼠神经系统的保护作用

目的 基于Wnt/β-catenin信号通路探讨白芍总苷(TGP)对多发性硬化(MS)模型大鼠神经系统的保护作用。方法 将60只SD雌性大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组,每组各15只,足跖皮下注射抗原乳剂(豚鼠脊髓匀浆抗原与福氏佐剂)构建MS大鼠模型,对照组给予等体积的生理盐水灌胃; 低剂量组和高剂量组则在抗原乳剂注射后分别灌胃给予25、50 mg/kg的TGP,连续给药14 d,对照组和模型组给予等量生理盐水; 观察大鼠临床发病、体重变化与神经功能评分情况,HE染色观察大鼠脊髓组织病理变化,TUNEL法观察神经细胞凋亡,Western blot检测Wnt3α,GSK-3β,β-catenin,Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果 模型组和低、高剂量组大鼠体重明显低于对照组; 模型组第8 d开始体重明显低于其它3组(P<0.05); 低剂量组第12 d开始体重明显低于高剂量组(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠神经功能评分、细胞凋亡指数(Apoptosis index,AI)、Wnt3α,β-catenin水平明显升高,Bcl-2/Bax,GSK-3β水平明显降低(P均<0.05); 与模型组比较,低、高剂量组神经功能评分、AI数值、Wnt3α,β-catenin水平明显降低,Bcl-2/Bax,GSK-3β水平明显升高(P均<0.05),且高剂量组较低剂量组变化更明显(P<0.05)。结论 TGP可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活来发挥对MS模型大鼠神经系统的保护作用。     

芍药苷对蛛网膜下腔出血早期脑损伤大鼠NLRP3炎性小体表达的影响

目的 探究芍药苷(Paeoniflorin,PAE)对蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)早期脑损伤大鼠NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小体表达的影响。方法 将60只大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(SAH)组、芍药苷低剂量(PAE-L)组、芍药苷高剂量(PAE-H)组; Sham组不刺破血管,其余各组采用血管内穿孔法构建SAH大鼠模型; PAE-L组、PAE-H组腹腔注射对应剂量的芍药苷(10、20 mg/kg),Sham组、SAH组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液,2次/d,共3 d; 采用Garcia评分法评估大鼠神经功能; SAH评分法评估蛛网膜下腔出血情况; 脑组织含水量测定评估脑水肿; 伊文思蓝(Evans blue,EB)染色评估血脑屏障通透性; 苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察大鼠脑组织病理损伤; TdT介导的dUTP末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色检测神经元凋亡; 免疫荧光染色检测NLRP3、离子钙结合衔接分子-1(Ionized calcium binding adapter molecule-1,Iba-1)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)表达水平; 免疫组化染色检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Cysteinyl aspartate-specific proteinase,Caspase-1)表达水平; Western Blot检测B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X的蛋白质(Bcl-2-Associated X protein,Bax)、Caspase-3,NLRP3,ASC,Caspase-1、白介素-1β(Interleukin-1 β,IL-1β)、IL-18、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Iba-1和MPO表达水平。采用氧化血红蛋白(Oxygenated hemoglobin,OxyHb)构建原代皮层神经元体外SAH模型,并将其分为对照(Control)组、模型(OxyHb)组、芍药苷低剂量(PAE-L)组和芍药苷高剂量(PAE-H)组; Control组正常培养,OxyHb组、PAE-L组、PAE-H组神经元在含20 uM OxyHb的神经元培养基中培养,PAE-L组、PAE-H组分别加入对应剂量的芍药苷(10、20 uM); 各组神经元孵育48 h; 采用细胞计数试剂盒8(Cell counting kit 8,CCK8)法和TUNEL染色检测神经元活性及凋亡; Western Blot检测Bcl-2,Bax,Caspase-3的表达水平。结果 动物模型显示,Sham组大鼠脑组织未见积血,脑组织细胞结构清晰可辨; 与Sham组比较,SAH组脑组织可见大量积血,脑组织细胞排列松散,Garcia评分降低(P<0.05),SAH评分、脑含水量、EB渗出量升高(P<0.05),神经元TUNEL阳性细胞数增加(P<0.05),Bcl-2表达水平降低,Bax,Caspase 3,NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18,TNF-α表达水平升高(P<0.05),Iba-1和MPO阳性细胞数增加(P<0.05); 与SAH组比较,PAE-L组、PAE-H组脑组织积血减少,脑组织细胞状态趋于正常,Garcia评分升高(P<0.05),SAH评分、脑含水量、EB渗出量降低(P<0.05),神经元TUNEL阳性细胞数减少(P<0.05),Bcl-2表达水平升高,Bax,Caspase 3,NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18,TNF-α表达水平降低(P<0.05),Iba-1和MPO阳性细胞数减少(P<0.05)。细胞模型显示,Control组神经元形态正常; 与Control组比较,OxyHb组神经元肿胀,突触丧失,神经元活性降低,凋亡率增高(P<0.05),Bcl-2表达水平降低,Bax,Caspase 3表达水平升高(P<0.05); 与OxyHb组比较,PAE-L组、PAE-H组细胞损伤减轻,神经元活性升高,凋亡率降低(P<0.05),Bcl-2表达水平升高,Bax,Caspase 3表达水平降低(P<0.05)。结论 芍药苷能够减轻SAH后大鼠脑水肿、细胞凋亡和神经损伤,其机制可能为通过抑制NLRP3炎性小体的激活,并抑制小胶质细胞和中性粒细胞浸润,改善SAH后早期脑损伤。     

15d-PGJ2对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤小胶质细胞活化及神经细胞凋亡的影响

目的 观察PPAR-γ激动剂15d-PGJ2对糖尿病脑缺血再灌注大鼠脑缺血再灌注损伤小胶质细胞活化及神经细胞凋亡的影响。方法 成年SD大鼠80只,随机分为4组:(1)假手术组;(2)正常血糖脑缺血组;(3)糖尿病脑缺血组;(4)糖尿病脑缺血+15d-PGJ2干预组。采用链脲佐菌素诱导糖尿病,应用改良的Zea-Longa法制作大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型。糖尿病脑缺血组+15d-PGJ2干预组在成功制备糖尿病大鼠模型后给予15d-PGJ2 200 μg·kg^-1·d^-1腹腔注射21 d后应用改良的Zea-Longa法制作大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,再灌注后3 h腹腔注射15d-PGJ2 400 μg·kg^-1,以后6 d每天给予15d-PGJ2 200μg·kg^-1·d^-1腹腔注射。每组分别于24 h、7 d各处死一批大鼠,并随机分为2组:一组行免疫组化法检测小胶质细胞CD68的表达水平及ELISA检测TNF-α与IL-1β水平,另一组用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞计数。结果 正常血糖脑缺血组、糖尿病脑缺血组、糖尿病脑缺血+15d-PGJ2干预组与假手术组比较,再灌注24 h、再灌注7 d CD68阳性面积、TNF-α与IL-1β水平、神经细胞凋亡率均明显增加(P<0.05); 糖尿病脑缺血组在再灌注24 h、再灌注7 d CD68阳性面积、TNF-α与IL-1β水平、神经细胞凋亡率明显高于正常血糖脑缺血组(P<0.05); 糖尿病脑缺血+15d-PGJ2干预组再灌注24 h、再灌注7 d CD68阳性面积、TNF-α与IL-1β水平、神经细胞凋亡率低于未干预组(P<0.05)。结论 糖尿病脑缺血组与正常血糖脑缺血组相比较CD68阳性面积更大、TNF-α与IL-1β水平更高及神经细胞凋亡率更高; 15d-PGJ2可减少糖尿病脑缺血大鼠小胶质细胞激活、减少炎症因子分泌、降低神经细胞凋亡率。