大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：提供肝细胞生长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。 目的：实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化。 设计、时间及地点：观察实验，于2006-10/2008-05在北华大学完成。 材料：实验动物为成年SD大鼠，雌雄不限，体质量180~230 g。 方法：采用Percoll梯度离心方法获取骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为1×108 L-1,加入含有20 μg/L肝细胞生长因子培养液培养，定期更换培养液。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。培养的1，3，7， 14， 21， 28 d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达。 结果：接种后，细胞体积增大，形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形，胞浆丰富，可见多核，接种早期细胞生长比接种晚期生长较快。分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29+，CD44+，CD34-，CD45-和CD90+，细胞的碱性磷酸酶染色阴性，细胞纯度达98%以上。骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性，第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性。 结论：成年大鼠骨髓间充质干细胞在20 μg/L肝细胞生长因子的诱导下，可分化为肝细胞。     

生长因子对骨骼肌肌源性干细胞增殖的影响★

背景：单纯应用差速贴壁法获得的原代肌源性干细胞数量少，生长速度较慢，不利于获取满足实验及将来临床所需的细胞数量。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1在体外对体外培养肌源性干细胞增殖的作用，探索体外大量培养肌源性干细胞的方法和条件。 设计、时间及地点：观察对比实验，于2007-09/2008-04在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。 材料：2周龄体质量50~80 g的SD大鼠20只。 方法：采用改良差速贴壁培养法分离大鼠骨骼肌肌源性干细胞：取新生大鼠肌肉标本分离细胞；维持总的贴壁时间基本不变，减少贴壁次数，取第2代肌源性干细胞进行体外成肌分化。 主要观察指标：以免疫细胞化学法及免疫荧光法鉴定肌源性干细胞。以MTT 比色实验检测5，10，20，40，80 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖的影响。以流式细胞仪检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1 和胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对细胞周期的影响。 结果：肌源性干细胞原代培养70 h后开始贴壁，呈规则的圆形。1周后细胞数量增多，细胞展开呈纺锤性。免疫细胞化学染色法和细胞免疫荧光法显示肌源性干细胞呈结蛋白、干细胞抗原1和CD34阳性。传代细胞加入碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1后肌源性干细胞的增殖活性增强，两种细胞因子作用强度相近，随着两种细胞因子浓度的提高促细胞增殖作用逐渐提高,在达到有效浓度后作用趋于饱和。两种细胞因子作用机制不同，碱性成纤维细胞生长因子主要是增加G2M期的细胞比例，通过缩短细胞周期达到增殖作用, 胰岛素样生长因子1则主要增加S期细胞的比例，通过活化由G0期到G1期转化的进入有丝分裂细胞来达到增殖作用。 结论：胰岛素样生长因子1 和碱性成纤维细胞生长因子都具有刺激肌源性干细胞增殖的作用，两者联合作用既可以增加早期由G0期进入G1期的数量，又可以减短细胞有丝分裂周期，从而达使促增殖效果更快、更强。     

大鼠附睾脂肪垫脂肪源性干细胞的分离培养及分化潜能

背景：相对于骨髓基质干细胞,脂肪源性干细胞来源丰富,取材方便,干细胞丰度高,极易培养,具有多向分化潜能,有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的源细胞,但目前对脂肪源性干细胞的研究尚处于初级阶段。 目的：拟在体外分离培养大鼠脂肪源性干细胞,并探讨其分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在南方医科大学组胚教研室和南方医院临床医学实验中心完成。 材料：SPF级成年雄性SD大鼠1只,由南方医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧附睾尾脂肪垫,胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第4代脂肪源性干细胞接种到96孔板,5×104个细胞/皿,待细胞贴壁后分成3组：成骨诱导组加入成骨培养基,成脂诱导组加入成脂培养基,对照组仍用基础培养基,培养14 d。 主要观察指标：脂肪源性干细胞的形态变化、体外增殖能力、细胞免疫化学鉴定结果。脂肪源性干细胞成骨和成脂分化能力。 结果：体外培养的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞为主,呈旋涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈“S”形;细胞表面标志CD44和CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。脂肪源性干细胞经成骨诱导7 d后,碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,油红O染色示胞浆内有脂滴出现;对照组细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,无脂滴存在。 结论：从大鼠附睾脂肪垫内分离的脂肪源性干细胞易于培养和传代扩增,在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及

背景：间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点。 目的：对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较。 设计：体外细胞学对比观察。 材料：新鲜脐带血在征得产妇同意后采集。骨髓由健康的成年志愿者捐赠。 方法：取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察。 主要观察指标：两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定。 结果：两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性：传代培养潜伏期为24~36 h,传代培养对数增殖期为接种后3～7 d,接种后八九天,生长进入平台期;脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45;脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞。 结论：人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增;脐带血的间充质干细胞原代贴壁时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞

背景：国内均可见有探讨脂肪干细胞向神经元诱导分化的相关研究报道,但运用差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞,多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的研究鲜有报道。 目的：观察多因子联合诱导和分步诱导方案诱导大鼠脂肪组织源性干细胞体外分化为神经元样细胞的可行性。 方法：取SD雄性大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织,酶消化法分离、差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞。免疫荧光细胞化学法鉴定脂肪组织源性干细胞(CD44,CD49d,CD106);“鸡尾酒”式神经元诱导培养基对脂肪组织源性干细胞进行诱导分化,并用免疫荧光细胞化学法鉴定(Nestin和NeuN)分化结果。 结果与结论：大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织内分离、原代培养的脂肪组织源性干细胞形态均一,呈长梭形,细胞核椭圆形,核仁明显,细胞质染色浅,呈旋涡状克隆样生长;CD44和CD49d阳性表达而CD106阴性;诱导培养基内培养6 h后脂肪组织源性干细胞呈锥体形或不规则,有短而细的指状突起;24 h后多数细胞显示类神经元的形态学特征,且Nestin和NeuN阳性。提示肪组织源性干细胞在多因子“鸡尾酒”式培养基内可向神经元方向分化。     

成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能，但骨髓中间充质干细胞的含量极少，因此体外纯化和扩增极其重要。 目的：拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法，观察其增殖及生长特性。 设计、时间及地点：单一样本观察实验，于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓血来源于成人肋骨骨髓。 方法：收集成人骨髓血，采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞，根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80 ℃条件下冻存，24 h后复苏，观察活细胞数，按2×103/cm2种植扩增，扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。 主要观察指标：倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞抗原表达，采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。 结果：原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24 h后贴壁细胞数量明显增多, 3 d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆，散在分布，大部分细胞呈纺锤形。7~9 d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍；10~12 d，细胞数量增加了约20倍，铺满了全层，细胞排列也有一定的方向性，呈旋涡样生长，旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105，不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示，第2~6天为生长潜伏期，第8~10天进入对数增长期，第12~14天进入个平台期；传代培养的潜伏期为24~48 h，对数增长期为4~6 d，细胞的增殖、生长逐渐缓慢，接种后8到9天进入平台期。 结论：利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力，表达CD105、KDR，不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。     

人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景：组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。 目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成。 材料：胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者。 方法：采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养人骨髓基质干细胞。 主要观察指标：用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力。 结果：镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR。两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强。 结论：人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力。     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。 目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。 方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1 Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。 结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14 d后,Von Kossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

大鼠肌源性干细胞移植对失神经腓肠肌萎缩进程的影响

背景：目前，国内外有关肌源性干细胞移植的研究主要集中在治疗肌营养不良性萎缩症方面，尚未见涉及将肌源性干细胞应用于失神经肌萎缩综合治疗的报道。 目的：探讨大鼠肌源性干细胞移植对失神经腓肠肌萎缩进程的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物观察，于2007-02/2008-07在沈阳医学院完成。 材料：成年健康雄性Wister大鼠19只，由沈阳医学院实验动物中心提供。 方法：取3只大鼠，无菌条件下切取肱三头肌，体外分离培养肌源性干细胞，贴壁法纯化扩增。余16只大鼠均切断右后肢胫神经，建立失神经腓肠肌模型，分为2组：细胞移植组于已切断的胫神经支配的腓肠肌的内外侧注射经DAPI标记的肌源性干细胞悬液0.2 mL，模型对照组于相同位置注射等量生理盐水，培养4周。 主要观察指标：采用计算机生物信号采集处理系统测定反映肌张力的腓肠肌阈强度恢复率和最适强度恢复率变化，通过电子天平计算肌湿质量残存率，应用图像分析系统测定肌纤维横截面积残存率。 结果：与模型对照组比较，细胞移植组失神经腓肠肌的阈强度恢复率、最适强度恢复率均明显降低(P < 0.01，P < 0.05)，肌湿质量残存率、肌纤维横截面积残存率均明显升高(P < 0.01)。 结论：肌源性干细胞移植对大鼠失神经肌萎缩进程有较明显的延缓作用。     

成体组织来源的Sca-1+CD117-Lin-多潜能干细胞生物学特性分析

背景：关于成体干细胞可塑性机制的解释，目前多数学者接受的观点是多种组织器官内存在的成体干细胞其实并非均一的细胞群体，其中包含着更为原始的多潜能干细胞，但对于多潜能干细胞的起源、鉴别及其生物学特性仍缺乏了解。 目的：探讨从成体组织中能否分离出一群具有独特表型的更为原始的多潜能干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-03/2008-01在北京协和医学院基础学院组织工程中心完成。 材料：清洁级12.5~14.5 d BALB/C孕鼠10只。 方法：无菌条件下打开BALB/C孕鼠子宫获取胚胎体壁组织，胰蛋白酶消化后贴壁法制成细胞悬液，接种后免疫磁珠分选Sca-1+CD117-Lin-细胞群，当细胞达70%~80%融合时消化传代，取第5代细胞用于实验。 主要观察指标：倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察该类细胞的显微和超微形态，通过生长曲线和细胞周期观察其基本生长特性，采用流式细胞技术分析该群细胞免疫表型，以RT-PCR法检测胚胎干细胞相关抗原的表达情况，通过Von Kossa染色、油红O染色、甲苯胺蓝染色及免疫细胞荧光染色观察其向三胚层细胞分化的潜能。 结果：Sca-1+CD117-Lin-细胞贴壁生长，呈纺锤或短梭形，可在体外快速稳定扩增50代以上；传代后3~7 d为对数生长期，此后即进入平台期生长，倍增时间约为32 h，90.43%细胞处于G0/G1期，G2/M+S期的细胞比例为9.57%；细胞表型稳定，高表达Sca-1，不表达CD117，CD14，CD19，CD31，CD34，CD45和Flk-1，中度表达CD44；胚胎干细胞相关抗原Sox2，Oct-4及Nanog均呈阳性表达；诱导分化实验表明该细胞可以向中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、外胚层来源的神经胶质细胞以及内胚层来源的肝细胞分化。 结论：从成体组织内可以分离出Sca-1+CD117-Lin-细胞群，其表达胚胎干细胞相关抗原，能够向三胚层分化，是一群更为原始的多潜能成体干细胞。     

Protein hairy enhancer of split-1 expression during differentiation of muscle-derived stem cells into neuron-like cells

Muscle-derived stem cells were isolated from the skeletal muscle of Sprague-Dawley neonatal rats aged 3 days old. Cells at passage 5 were incubated in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum, 20 μg/L nerve growth factor, 20 μg/L basic fibroblast growth factor and 1% (v/v) penicillin for 6 days. Cells presented with long processes, similar to nerve cells. Connections were formed between cell processes. Immunocytochemical staining with neuron specific enolase verified that cells differentiated into neuron-like cells. Immunofluorescence cytochemistry and western blot results revealed that the expression of protein hairy enhancer of split-1 was significantly reduced. These results indicate that low expression of protein hairy enhancer of split-1 participates in the differentiation of muscle-derived stem cells into neuron-like cells.     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定*☆

背景：当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞。 目的：通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础。 方法：绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分子CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-lectin和DiI标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能。 结果与结论：绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3~5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%;免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达。细胞能同时吞噬FITC-labeled BS-1-lectin,DiI-ac-LDL阳性率达85.3%。证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞。     

Differentiation of embryonic versus adult rat neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro

BACKGROUND:It has been reported that the conversion of neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro can be increased through specific cytokine combinations. Such neural stem cell-derived dopaminergic neurons could be used for the treatment of Parkinson’s disease. However, little is known about the differences in dopaminergic differentiation between neural stem cells derived from adult and embryonic rats. OBJECTIVE: To study the ability of rat adult and embryonic-derived neural stem cells to differen...     

猪外周血内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

背景：内皮祖细胞是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,研究表明猪的心血管解剖结构较其他低等哺乳动物更接近于人类,用其建立心血管疾病模型更具临床意义。 目的：拟在体外建立猪外周血内皮祖细胞的分离培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-09/2008-05在美国纽约州布法罗大学心血管疾病研究中心和首都医科大学病理生理学教研室完成。 材料：12周龄健康成年猪6只,由布法罗大学实验动物中心提供。 方法：采集猪外周血,以梯度密度离心法分离血单核细胞,按3×107/孔密度接种于预先包被Ⅰ型鼠尾胶原的6孔培养板,每孔加入EGM-2内皮细胞生长培养液2 mL,贴壁法纯化扩增,取传至第2代细胞用于指标检测。 主要观察指标：采用免疫荧光染色和流式细胞仪检测内皮祖细胞表面抗原的表达,通过内吞DiI-acLDL和Matrigel血管形成实验进行细胞功能学鉴定,将第2~10代细胞按500个/孔接种后检验其克隆形成能力。 结果：猪外周血单核细胞体外培养7~10 d后,出现呈铺路石样的细胞克隆,表达内皮祖细胞表面抗原CD9,CD31,CD105,VE-Cadherin,VEGFR2和内皮源性一氧化氮合酶,部分细胞表达干细胞标志c-Kit,但不表达CD133和造血祖细胞标志CD45。细胞能内吞DiI-acLDL,在Matrigel上可以形成毛细血管样结构,且具有很强的克隆形成能力。第2,4,6,8,10代细胞克隆数及内皮祖细胞总数均基本相似（F =0.167,F=0.195,P > 0.05）。 结论：梯度密度离心联合贴壁法可成功从猪外周血中分离培养出内皮祖细胞,体外扩增后细胞增殖能力无变化。     

维甲酸诱导胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元的分化

背景：目前认为直接进行神经干细胞移植后细胞虽能存活,但是只分化成神经胶质细胞,并不能分化成有功能的神经元。 目的：探讨维甲酸诱导对胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外实验,于2008-09/2009-02在辽宁医学院科技实验楼完成。 材料：胚龄13.5 d的SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。 方法：分离胎鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化法体外培养获得神经干细胞。将原代和传代细胞以1×107 L-1接种到培养孔中,分别进行常规贴壁分化培养和维甲酸诱导分化培养。 主要观察指标：神经干细胞的鉴定,光镜及免疫组化检测神经干细胞诱导分化结果。 结果：免疫组织化学检测结果显示,原代和传代后得到的神经干细胞团均呈巢蛋白阳性。常规贴壁分化培养7 d后,神经元多呈椭圆型和近似三角形,胞体大,细胞边缘清楚,胞体上有多个突起;而维甲酸诱导分化培养后,神经元数量增加,形态清楚,但细胞胞体上突起较少。与常规贴壁分化培养比较,维甲酸诱导分化培养后神经干细胞向神经元分化率明显升高(P < 0.01),神经干细胞向神经胶质细胞分化率明显降低(P < 0.01)。 结论：从大鼠胚胎脑海马组织中分离得到可自我复制和多向分化的神经干细胞,维甲酸体外诱导后可以增加其向神经元方向分化的比例。     

人骨髓CD34+干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用

背景：有研究证实，骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能。 目的：体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞，并检测其免疫学表型，观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：骨髓来源于健康供者。 方法：利用Percoll 梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞。采用脂质体介导转染法，选生长良好的传代细胞，以血管内皮生长因子165 基因转染人骨髓CD34+干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型。经血管内皮生长因子165 基因转染后，人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况。 结果：体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞，细胞形态呈成纤维细胞样。CD44、CD29和c-kit阳性，CD31和CD54阴性；经血管内皮生长因子165 诱导后，人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44 表达降低，CD31升高，呈现典型的内皮细胞表型，并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力。 结论：采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离，可培养扩增出高度同源的CD34+干细胞，经血管内皮生长因子基因转染后，CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型，验证了其具有向内皮细胞分化的潜能。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景：体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素。 目的：在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。 材料：14~16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代。 主要观察指标：免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况。 结果：培养48~72 h细胞聚集悬浮生长,形成典型的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达。传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5~7 d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。 结论：利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞。