钙结合蛋白Calbindin在FMR1基因敲除小鼠脑组织中的表达

目的探讨脆性X综合征中钙结合蛋白Calbindin在神经元树突棘形态异常中的作用。方法我们选用FVB品系的FMR1基因敲除型(KO)和野生型(WT)小鼠,分别取新生1、3、5、7、10、14d,及成年(6周)的KO小鼠以及WT小鼠用免疫组织化学方法检测钙结合蛋白Calbindin在脑组织中的分布和表达情况,分别对大脑纹状皮质、海马、颞叶听区、梨状皮质、丘脑及小脑的免疫阳性显色细胞进行检测。结果在新生1d龄WT型及KO型小鼠中Calbindin免疫阳性细胞首先出现于梨状皮质和小脑皮质中,随着天龄的增长脑内其他各区逐渐出现Calbindin免疫阳性细胞的表达,且≤10dKO型小鼠Calbindin免疫阳性细胞平均光密度均显著高于WT型小鼠(P<0.05)。结论FMRP通过负性调节脑内钙结合蛋白Calbindin的表达,这推测与FMR1基因敲除小鼠神经元树突和树突棘形态异常有关。     

肌萎缩侧索硬化症相关基因VAPB对皮质神经元存活及突触蛋白表达的影响

目的探讨肌萎缩侧索硬化症(ALS)致病基因VAPB P56S突变对原代培养皮质神经元的细胞活性及突触蛋白表达的影响。方法以非转基因(nTg)和VAPB P56S转基因(P56S Tg)新生小鼠为细胞来源,体外培养皮质神经元10d和20d后,分别利用MTT法和Western blot法检测皮质神经元存活率以及突触蛋白表达水平。结果与nTg小鼠的皮质神经元比较,VAPB P56S转基因小鼠的皮质神经元在体外培养20d时细胞活力显著降低(P0.0001),而在体外培养10d时无明显差异(P=0.5140),但突触囊泡膜蛋白SV2C(P0.0001)、突触囊泡结合蛋白VAMP2(P=0.0047)、突触小体相关蛋白SNAP25(P0.0001)和突触后致密蛋白PSD95(P0.0001)表达水平均显著降低。结论 VAPB P56S降低原代皮质神经元活性,并在神经元变性死亡前即损害突触结构和功能相关蛋白的表达。     

运动神经元病相关蛋白p150glued在自噬通路中的功能

目的探讨运动神经元病相关蛋白p150glued在自噬通路中的作用和功能。方法以1.5个月龄C57BL/6J野生型小鼠和HEK293细胞为材料,利用转染和蛋白印迹(Western blot)法检测p150glued缺失对于Dynactin亚基表达水平以及自噬-溶酶体蛋白降解通路中关键蛋白的影响。结果 p150glued在小鼠神经系统中表达广泛,且与脊髓相比,坐骨神经中其含量显著下降(P0.05)。p150glued蛋白缺失引起动力蛋白激活蛋白Dynactin亚基DCTN4、DCTN5、p50和Arp1a蛋白表达水平显著下降(P0.05)。p150glued蛋白含量下调使自噬-溶酶体蛋白降解通路中LC3A/B-II、p62和LAMP1蛋白表达水平显著提高(P0.05),而ATG3、ATG7和LC3A/B-I蛋白含量未发生明显变化(P0.05)。结论运动神经元病相关蛋白p150glued含量减少可通过引起Dynactin亚基表达水平下降,使自噬小体和溶酶体运输障碍,从而导致自噬-溶酶体蛋白降解通路异常。     

p150glued对脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入的调控

目的 探讨运动神经元病相关蛋白p150glued在脊髓前角的亚细胞定位及其对小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入的调控作用。方法 通过免疫荧光染色技术观察p150glued在小鼠脊髓前角处亚细胞定位情况,以及对照组Ctrl小鼠和p150glued条件性敲除cKO小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触前标记物VGLUT1含量变化情况。结果 在小鼠脊髓前角,p150glued的强阳性信号与VGLUT1存在共定位。在6月龄cKO小鼠中进一步发现,p150glued缺失的脊髓运动神经元膜上VGLUT1阳性点状信号多于Ctrl小鼠。结论 p150glued富集于兴奋性谷氨酸能突触前,p150glued缺失可增加6月龄小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入。     

p150glued缺失小鼠的脊髓运动神经元中NMDA受体增多

目的 探讨运动神经元病致病基因Dctn1编码蛋白p150glued对小鼠脊髓运动神经元中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的影响。方法 利用蛋白印迹法检测p150glued缺失(cKO)小鼠及对照(Ctrl)小鼠脊髓中NMDA受体亚基NR1和NR2B的含量。利用免疫荧光染色法观察Ctrl和cKO小鼠脊髓运动神经元中NRI分布的变化。结果 与Ctrl小鼠相比,6月龄cKO小鼠脊髓组织中NR1和NR2B的蛋白水平明显增加,cKO小鼠脊髓运动神经元中NR1阳性斑点数也明显增多、增大。结论 神经元中p150glued缺失可以引起6月龄小鼠脊髓运动神经元中NMDA受体亚基NR1和NR2B增多。     

MicroRNA-134在FMR1基因敲除鼠脑组织中的表达及意义

目的 观察脆性X综合征(FXS)模型小鼠不同发育时期脑组织中microRNA-134(miR-134)的表达,明确miR-134的表达特点及脆性X智力低下蛋白(FMRP)缺失是否导致miR-134转录的改变. 方法 应用荧光实时定量PCR检测FVB近交系雄性0 d、4、6周(W)龄FMR1基因敲除型(KO)(KO0d、KO4w、KO6w)和同龄野生型(WT)(WT0d、WT4w、WT6w)小鼠脑组织中miR-134的表达(n=5). 结果同龄KO与WT小鼠miR-134的转录表达量差异无统计学意义(P＞0.05);KO6w小鼠脑组织miR-134的转录表达量低于KO0d和KO2w小鼠,WT6w小鼠脑组织miR-134的转录表达量也低于WT0d和WT2w小鼠,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 FMRp的缺失并未影响miR-134的转录;miR-134的转录表达量在神经系统发育期保持着较高水平,至成年期则下降,提示其在调控神经系统发育中可能起着重要作用.     

p150glued功能缺失引起小鼠骨骼肌去神经支配

目的探讨家族性运动神经元病致病基因DCTN1编码的p150glued蛋白功能缺失对于小鼠脊髓运动神经元对骨骼肌神经支配的影响。方法免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术检测对照小鼠(Dctn1~(LoxP/LoxP))和p150glued功能缺失小鼠(Dctn1~(LoxP/LoxP); Thy1-Cre)的运动神经元轴突末梢对腓肠肌的神经支配情况。结果与Dctn1~(LoxP/LoxP)小鼠相比,Dctn1~(LoxP/LoxP);Thy1-Cre小鼠腓肠肌神经肌肉接头处脊髓运动神经元轴突末梢中p150glued缺失,9月龄时可检测到显著的腓肠肌去神经支配(P <0.05)。结论 p150glued功能缺失在导致小鼠脊髓运动神经元变性死亡之前即引起小鼠脊髓运动神经元轴突末梢变性和小鼠骨骼肌去神经支配。     

FMR1基因敲除小鼠脑组织微白蛋白表达的改变及其意义

目的 探讨微白蛋白(PV)阳性中间神经元在脆性X综合征(FXS)癫痫易感性增加中的作用. 方法 应用免疫组织化学染色检测FVB近交系雄性2、4、6 W龄FMR1基因敲除型(KO)(KO2W、KO4W、KO6W)和同龄野生型(WT)(WT2W、WT4W、WT6W)小鼠大脑纹状皮质、颞听皮质、梨状皮质及海马CA1区、CA3区、齿状回中PV的表达(n=6);应用Western blot法检测上述小鼠大脑皮层、海马组织PV的含量(n=6). 结果 KO2W、KO44W小鼠的大脑纹状皮质、颞听皮质、梨状皮质、海马CA1和CA3区PV阳性中间神经元的数量分别较WT2W、WT4-小鼠减少,差异有统计学意义(P<0.05);KO2W和KO4W小鼠大脑皮层、海马中PV含量分别较WT2W、WT4W小鼠减少,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 PV阳性中间神经元及PV含量的减少.可能是引起FXS模型鼠癫痫易感性增加的主要原因.     

TLR3在poly（I：C）-LMW预处理后缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的表达意义

目的观察TRL3激动剂poly（I：C）-LMW预处理对原代皮质神经元Toll样受体3（TLR3）表达的影响,探讨TLR3在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元损伤中的作用。方法取体外培养7d的大鼠原代皮质神经元细胞,对细胞分别予以正常条件下培养（空白对照组）;缺糖缺氧2h,复糖复氧24h（OGD组）;TRL3激动剂预处理12h（激动剂组）;TRL3激动剂预处理12h后缺糖缺氧2h,复糖复氧24h（激动剂＋OGD组）。免疫荧光法观察各组细胞生长状态,分别以Western blot法、RT-PCR法测定TLR3蛋白及TLR3mRNA的表达情况。结果 与空白对照组相比,激动剂及缺氧复氧处理方法均诱导原代皮质神经元TLR3、TLR3mRNA表达增强（P〈0.05）;激动剂预处理后,与OGD组相比,激动剂＋OGD组神经元细胞状态较好,数目较多（P〈0.05）。结论 TLR3参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的损伤过程,激动剂可减轻神经元缺糖缺氧后损伤。     

miR-132在氧糖剥夺诱导原代皮质神经元缺血损伤中的作用

目的探讨miR-132在氧糖剥夺诱导原代皮质神经元缺血损伤中的作用。方法体外培养原代皮质神经元细胞,构建氧糖剥夺(OGD/R)模型模拟缺血再灌注损伤。细胞随机分为假手术组(Sham)、OGD组、慢病毒对照组(LV-control)、miR-132低表达组(LV-anti-miR-132)、miR-132过表达组(LV-miR-132)。采用CCK-8、real-time PCR、Western blot等技术研究miR-132对OGD损伤原代皮质神经元的影响和机制。结果 miR-132在OGD诱导的缺血损伤模型中表达水平明显降低(P 0.05);在OGD诱导原代皮质神经元缺血损伤过程中,降低miR-132的表达,会加剧OGD损伤明显减少细胞活力;增加miR-132表达水平,会减轻OGD损伤提升细胞存活率。Western blot结果显示,过表达miR-132会上调突触相关蛋白Synapsin-1、PSD95蛋白表达水平。结论过表达miR-132通过上调突触相关蛋白Synapsin-1、PSD95的表达水平改善OGD诱导的缺血损伤,提高原代皮质神经元的存活率。