miR-129-5p靶向调节果蝇形态同系物2基因抑制喉鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的　探讨miR-129-5p对喉鳞癌细胞增殖、凋亡的调控机制。方法　运用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time f luorescence quantification polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测人支气管上皮细胞HBE、喉鳞状细胞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p、DIAPH2的表达；将miR-NC组（转染miR-NC）、miR-129-5p组 （转染miR-129-5p mimics）、anti-miR-NC组（转染antimiR-NC）、anti-miR-129-5p组（转染anti-miR-129-5p）、si-NC组（转染si-NC）、si-DIAPH2（果蝇形态同系物2，Drosophila Homologue of Diaphanous2，DIAPH2）组（转染si-DIAPH2）、miR-129-5p+pc DNA组（共转染miR-129-5p和pc DNA）、miR-129-5p+pc DNA-DIAPH2组（共转染miR-129-5p和pc DNA-DIAPH2），用脂质体法转染HN4、TU177细胞；Western blot检测细胞中DIAPH2、细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cleaved-caspase-9）的蛋白表达；MTT法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-129-5p与DIAPH2的结合力。结果　与人支气管上皮HBE相比，喉鳞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p 表达均显著降低，DIAPH2表达显著升高（P <0.05）；过表达miR-129-5p、敲减DIAPH2均可显著抑制HN4、TU177细胞增殖、促进凋亡、下调cyclinD1、上调cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9；miR-129-5p可抑制野生型DIAPH2细胞的荧光活性，并负向调控DIAPH2的表达；过表达DIAPH2可逆转miR-129-5p对Hep-2细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论　miR-129-5p可抑制喉鳞状细胞癌的增殖，促进凋亡，其机制可能与靶向DIAPH2相关，将可为miR-129-5p靶向治疗喉鳞状细胞癌提供新的依据。     

微小RNA-106a-5p/E2F3/β-catenin轴增加NK细胞对喉癌细胞的杀伤作用

目的　分析微小RNA-106a-5p（miR-106a-5p）/E2F3/β-catenin轴对喉癌细胞恶性发展的影响及其可能的作用机制。方法　通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测喉癌组织和癌旁组织中miR-106a-5p和E2F3的基因表达量。生物信息学软件及其双荧光素酶实验检测miR-106a-5p和E2F3之间的关系。下调miR-106a-5p和E2F3表达,CCK-8试剂盒检测喉癌Hep-2细胞的增殖能力,Western blot实验检测Hep-2细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）能力,检测NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）的分泌。estern blot分析miR-106a-5p通过E2F3对β-catenin通路的影响。进一步检测抑制β-catenin通路对Hep-2细胞恶性发展及NK细胞杀伤作用的影响。结果　喉癌组织中miR-106a-5p表达（0.62±0.08）低于癌旁组织（1.53±0.24）,E2F3表达（2.65±0.86）高于癌旁组织（1.48±0.74）。miR-106a-5p与E2F3特异性结合。下调miR-106a-5p促进Hep-2细胞增殖和EMT,抑制NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,而下调E2F3表达抑制Hep-2细胞增殖和EMT,上调NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性。下调miR-106a-5p通过E2F3激活β-catenin通路。XAV939干扰β-catenin通路后显著逆转了下调miR-106a-5p通对Hep-2细胞恶性发展以及NK细胞杀伤作用的影响。结论 miR-106a-5p靶向E2F3激活β-catenin通路调控喉癌细胞的恶性发展。     

miR-218-5p靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡影响

目的　探讨miR-218-5p对喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法  实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印记（Western blot）检测人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞和正常喉上皮细胞NPEC中miR-218-5p和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9（Poly ADP-Ribose polymerase 9，PARP9）的表达水平。构建过表达miR-218-5p或敲减PARP9的Hep-2细胞株，MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-218-5p和PARP9的靶向 调控关系。结果　与NPEC细胞相比，Hep-2细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低（t =19.540，P <0.05），PARP9的表达水平显著升高（t =25.381，P <0.05）。与miR-con组比较，miR-218-5p组Hep-2细胞存活率显著降低（F =37.167，P <0.05），凋亡率显著升高（F =670.506，P <0.05）。与si-con组比较，si-PARP9组Hep-2细胞存活显著降低（F =61.813，P <0.05），凋亡率显著升高（F =650.225，P <0.05）。miR-218-5p靶向负性调控PARP9表达。与miR-218-5p+pcDNA-con组比较，miR-218-5p+pcDNA-PARP9组Hep-2细胞存活显著升高（F =44.216，P <0.05），凋亡率显著降低（F =329.517，P <0.05）。结论　miR-218-5p通过靶向PARP9抑制喉鳞癌 细胞增殖，诱导细胞凋亡。     

微小RNA-548c-3p通过靶向调控PCNA基因表达对喉癌细胞增殖及凋亡影响的研究[论著]

目的　探讨微小RNA-548c-3p（miR-548c-3p）对喉癌细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法　用miR-548c-3p mimic、增殖细胞核抗原（PCNA）-siRNA及其阴性对照分别或同时转染喉癌TU686和M4e细胞,用qRT-PCR与Western blot法检测miR-548c-3p和PCNA的表达;MTT法和流式细胞术分别检测转染细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因实验观察miR-548c-3p和PCNA的靶向关系。Western blot法检测PCNA、细胞周期蛋白1（CyclinD1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）的表达。结果　miR-548c-3p的表达量在癌旁组织（0.74±0.10）、喉癌组织（1.94±0.16）,TU686细胞（0.35±0.07）和M4e细胞（0.41±0.03）中均呈低表达,而PCNA mRNA和蛋白均呈高表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）。证实PCNA上存在miR-548c-3p的结合位点。上调miR-548c-3p可抑制细胞增殖及CyclinD1、Bcl-2的表达,并可促进细胞凋亡及Bax的表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）;上调miR-548c-3与抑制PCNA对细胞增殖及凋亡的作用相似。pcDNA-PCNA显著减弱miR-548c-3p mimic对细胞增殖和凋亡的作用。结论　miR-548c-3p通过抑制PCNA表达而降低喉癌细胞增殖能力并诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

miR-30c对鼻咽癌CNE-1细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的 观察miR-30c对鼻咽癌CNE-1细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 过表达miR-30c质粒载体转染CNE-1细胞，同时设立空质粒载体转染阴性对照组和无处理的空白对照组。荧光定量PCR检测miR-30c表达水平，CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果 鼻咽癌组织中miR-30c的表达量为0.23±0.05，显著低于癌旁非肿瘤鼻咽组织的0.37±0.08（P <0.01）。过表达miR-30c组表达量（0.46±0.12）显著高于空白对照组（0.17±0.03）和阴性对照组（0.18±0.04）（P 均<0.01）。在24、48、72小时过表达miR-30c组OD值显著低于空白对照组和阴性对照组（P 均<0.01）。过表达miR-30c组G1期细胞比例（90.36±10.23）% 显著高于空白对照组（74.46±9.14）%和阴性对照组（75.25±9.23）%（P <0.01）。过表达miR-30c组凋亡细胞比例（31.06±5.12）%显著高于空白对照组（3.18±0.72）%和阴性对照组（3.56±0.78）%（P <0.01）。结论 过表达miR-30可以现在抑制鼻咽癌细胞增殖、细胞周期以及诱导细胞凋亡。     

MicroRNA-24对人喉鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨MicroRNA-24(miR-24)对喉鳞状细胞癌(LSCC)Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。 方法 应用Lipofectamine^TM 2000转染上调Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的表达,通过荧光定量PCR验证转染效率;然后分别采用MTT法、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验流式细胞分析技术分析外源上调miR-24后Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 结果 miR-24质粒稳定转染Hep-2、AMC-HN-8细胞后miR-24表达明显上调。与转染miR-NC组和空白对照组相比,转染miR-24能明显降低Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力;同时,转染miR-24能明显增加Hep-2、AMC-HN-8细胞的凋亡能力。 结论 miR-24异常表达与LSCC Hep-2、AMC-HN-8细胞的生物学行为密切相关,可能发挥抑癌作用。     

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的　探讨RNA干扰技术（RNAi）沉默肺腺癌转移相关转录本-1（MALAT-1）基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路影响。方法  体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞，命名为si-NC组、si-MALAT1组，未处理组作为空白对照组，分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、caspase-3 mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、Akt及其磷酸化蛋白（p-Akt）蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果　与正常细胞相比，喉癌Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（3.24±1.02）升高（P＜0.05）；与空白对照组、si-NC组相比，si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（0.47±0.08）及Bcl-2 mRNA（0.56±0.09）及蛋白（0.31±0.05）表达降低，细胞增殖抑制率及凋亡率[（20.48±3.41）%]均升高，Bax、caspase-3mRNA（3.02±0.50、2.58±0.43）及蛋白表达（0.86±0.14、0.94±0.16）均升高，p-PI3K、p-Akt蛋白表达（0.57±0.10、0.51±0.08）均降低（P 均＜0.05）。结论　MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率，推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。     

LncRNA SNHG12靶向结合miR-206对甲状腺乳头状癌增殖、凋亡及AKT3蛋白的作用机制CSCD

目的 研究lncRNA SNHG12靶向结合miR-206对甲状腺乳头状癌增殖、凋亡及AKT3蛋白的作用机制。方法选取2020年1月～2021年1月于新乡市中心医院接受治疗的甲状腺乳头状癌患者的癌组织与癌旁组织标本各10例作为研究对象。将甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1细胞分成3组：实验组（TPC-1常规培养无处理组）、转染组（SNHG12基因沉默组）和对照组（转染不相关序列组）。RT-PCR检测lncRNA SNHG12、miR-206水平，CCK-8检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫印迹检测AKT3，双荧光素酶报告检测lncRNA SNHG12靶向miR-206，双荧光素酶报告检测向miR-206靶向AKT3。结果 lncRNA SNHG12在甲状腺乳头状癌组织中的表达量高于癌旁组织（t=11.240,P<0.05）,miR-206在甲状腺乳头状癌组织中的表达量低于癌旁组织（t=6.795,P<0.05）。lncRNA SNHG12在正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中的表达水平最低，在TPC-1中的表达量高于在K1、BCPAP细胞中的表达（t=5.753,P<0.05）。miR-206在正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中的表达水平最高，在TPC-1细胞中的表达低于在K1、BCPAP细胞中的表达（t=11.000,P<0.05）。与对照组相比，转染组lncRNA SNHG12表达水平、细胞凋亡率、AKT3蛋白表达降低（t=5.306,P <0.05;t=19.850,P <0.001;t=12.440,P <0.001），而miR-206表达升高（t=2.504,P<0.05），转染组在24、48、72 h的细胞增殖低于对照组（F=42.000、69.740、52.510,P<0.01）。结论 低表达的lncRNA SNHG12通过靶向上调miR-206表达、抑制AKT3蛋白，从而抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进其凋亡。     

猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1靶向抑制微小RNA-515-5p表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响#br#

目的　探讨猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1（feline leukemia virus subgroup C virus receptor 1 antisense RNA 1，FLVCR1-AS1）对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法　以人永生化鼻咽上皮细胞NP69（简称NP69细胞）为对照，实时荧光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）法检测鼻咽癌细胞系（5-8F、C666-1、6-10B）中FLVCR1-AS1 和微小RNA（microRNA，miR）-515-5p表达。将C666-1细胞分为si-NC组、si-FLVCR1-AS1组、miR-NC组、miR-515-5p组、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组和si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组，CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖，划痕实验和Transwell检测分别检测细胞迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验验证FLVCR1-AS1和miR-515-5p调控关系。结果　鼻咽癌细胞系（5-8F、C666-1、6-10B）中FLVCR1-AS1表达高于NP69细胞（2.26±0.11、4.19±0.24、3.54±0.18 vs 1.00±0.00，P<0.05），而miR-515-5p表达低于NP69细胞（0.86±0.09、0.20±0.03、0.47±0.05 vs 1.00±0.00，P <0.05）。与si-NC组比较，si-FLVCR1-AS1组 C666-1细胞光密度（optical density，OD）值（0.59±0.03vs 1.34±0.08）、克隆数[（55.67±1.70）个vs（114.67±3.30）个]、迁移距离[（75.34±3.09）μm vs（186.29±9.29）μm]、侵袭数[（69.33±3.68）个vs（149.67±6.80）个]降低（P 均<0.05）。与miR-NC组比较，miR-515-5p组C666-1细胞OD值（0.51±0.04 vs 1.36±0.07）、克隆数[（46.67±1.25）个vs（115.67±4.11）个]、迁移距离[（65.89±1.96）μm vs（186.49±8.33）μ m]、侵袭数[（58.33±2.05）个vs（150.00±6.98）个]降低（P 均<0.05）。FLVCR1-AS1可靶向负调控miR-515-5p。与si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组比较，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组C666-1细胞OD值（1.16±0.06 vs 0.59±0.04）、克隆数[（106.00±3.56）个vs（55.33±2.49）个]、迁移距离[（164.06±7.40）μm vs （75.48±2.62）μ m]、侵袭数[（134.67±5.31）个vs（69.00±2.94）个]升高（P均<0.05）。结论　FLVCR1-AS1可能靶向下调miR-515-5p促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

Klotho基因在喉癌TU686细胞增殖和转移中的作用及调控机制

目的　探讨Klotho对喉癌TU686细胞增殖和转移的影响及其机制。方法　将TU686细胞分为对照组、空载体组和Klotho过表达组，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，平板克隆实验检测细胞克隆数，Transwell小室检测细胞迁移与侵袭，免疫印迹法检测Klotho和钙黏蛋白E（E-cadherin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白 （Vimentin）、β-连环蛋白（β-catenin）、c-myc、细胞周期素D1（CyclinD1）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达。结果　与对照组相比，Klotho过表达组细胞存 活率[（65.36±4.55）% vs（100.00±6.52）%]、克隆数（38.50±2.63 vs 67.36±4.50）、迁移细胞数（72.35±6.48 vs 126.85±11.56）、侵袭细胞数（47.93±3.23 vs 90.76±6.35）和N-cadher in（0.14±0.01 vs 0.62±0.03）、Vimentin（0.29±0.03 vs 0.76±0.05）、β-catenin（0.15±0.02 vs 0.82±0.06）、c-myc（0.22±0.03 vs 0.72±0.05）、CyclinD1（0.34±0.03 vs 1.18±0.09）、MMP-9（0.19±0.02 vs 1.09±0.08）蛋白表达水平明显降低，而细胞中Klotho（1.17±0.10 vs 0.33±0.02）和E-cadherin（0.85±0.06 vs 0.21±0.03）表达水平明显升高（P <0.05）；但空载体组与对照组间差异无统计学意义（P >0.05）。结论　Klotho可抑制喉癌TU686细胞增殖和转移，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

人喉鳞癌组织中c-myc蛋白的表达及c-myc siRNA下调喉癌Hep-2细胞中c-myc的表达对细胞增殖的影响

目的:检测喉鳞状细胞癌组织中c-myc的表达及利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制喉癌Hew2细胞中c-myc的表达对细胞增殖及抗凋亡的影响,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法:免疫组织化学法检测80例喉鳞状细胞癌和30例声带息肉组织中的c-myc和Rb蛋白的表达;利用RNAi技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western Blotting法检测c-myc蛋白的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达;MTT法检测转染c-myc siRNA 24、48、72 h后,或转染不同浓度的c-myc siRNA(25、50、75 nmol/L)培养72 h,或在转染后加入不同浓度的5-Fu培养48 h,细胞增殖情况;流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu联合应用对喉癌细胞凋亡的影响.结果:免疫组织化学结果显示c-myc蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达增强,Rb蛋白表达下降,二者存在负相关;Hep-2细胞转染c-myc siRNA后,c-myc蛋白和tuRNA的表达水平逐渐下调;MTT结果显示随着转染c-myc siRNA浓度的增加,Hep-2细胞的存活率受到明显的抑制,具有浓度依赖性;当转染c-myc siRNA(50 nmol/L)后Hep-2细胞的抑制效率随时间的延长而增加,具有时间依赖性;当联合使用5-Fu时,在同一浓度5-Fu作用下,转染c-myc siRNA组细胞的增殖活性明显受到抑制;凋亡检测结果显示,当c-myc siRNA与5-Fu联合使用时,可明显提高Hep-2细胞对5-Fu的敏感性,在较低剂量时凋亡细胞显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中存在c-myc的高表达,c-myc siRNA可以特异性地下调Hew-2细胞中c-myc的表达,抑制喉癌细胞的增殖,增加细胞对5-Fu的敏感性,表明c-myc或许可以成为喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.     

微小RNA-34a调节B淋巴细胞瘤-2基因引起耳蜗细胞凋亡在庆大霉素致聋大鼠中的机制研究

目的　探究微小RNA（microRNA，miR）-34a调节B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）引起耳蜗细胞凋亡在庆大霉素致聋大鼠中的作用机制。方法　将SD大鼠分为3个组，对照组、模型组和miR-34a抑制剂组。通过肌肉注射庆大霉素建立药物中毒性聋大鼠模型，尾静脉注射miR-34a抑制剂下调miR-34a水平。比较建模前、后听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）阈值。HE染色和免疫组织化学染色分别检测大鼠耳蜗形态改变和Bcl-2水平，实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）、免疫印迹试验（Western blot）分别检测RNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告实验验证miR-34a直接靶 向作用于Bcl-2。结果　注射庆大霉素后，对照组大鼠耳蜗毛细胞形态正常，排列规则，螺旋神经节结构正常；模型组耳蜗毛细胞数量显著减少，细胞排列不规则；miR-34a抑制剂组耳蜗细胞数量较模型组数量增加，细胞排列较规则。模型组大鼠躁动不安，易受惊，食欲减低，怕人怕物；miR-34a抑制剂组较模型组大鼠反应有所改善。模型组ABR（36.97±6.44）dB、miR-34a抑制剂组大鼠ABR（38.31±6.32）dB，均较对照组ABR（9.12±2.31）dB显著升高（t 模型组=45.682，t miR-34a抑制剂组=37.224，P 均<0.05）。尾静脉注射溶剂或miR-34抑制剂后，miR-34a抑制剂组ABR（20.05±4.62）dB，较模型组大鼠ABR水平（35.02±6.38）dB明显降低（t =16.334，P <0.05）。模型组miR-34a水平（3.45±0.32），显著高于对照组（1.07±0.11）（t =42.397，P <0.05），Bcl-2 mRNA水平（1.74±0.20）和Bcl-2水平 （0.89±0.09）显著低于对照组（3.82±0.43）和（2.96±0.32）（t Bcl-2 mRNA=29.358，t Bcl-2=36.445，P 均<0.05），miR-34a抑制剂组的miR-34a水平（1.34±0.15）较模型组（3.45±0.32）明显降低（t =28.752，P <0.05），Bcl-2 mRNA水平（2.43±0.31）和Bcl-2水平（1.56±0.17）显著高于模型组Bcl-2 mRNA （1.74±0.20）和Bcl-2水平（0.89±0.09）（t Bcl-2 mRNA=14.613，t Bcl-2=24.305，P 均<0.05）。双荧光素酶报告结果显示miR-34a直接靶向Bcl-2，推测人和大鼠的miR-34a靶向Bcl-2，且靶向结合位点具保守性。结论　miR-34a水平升高可能与药物引起的听力受损有关，通过抑制Bcl-2可下调庆大霉素致聋大鼠miR-34a表达水平，减少耳蜗中细胞凋亡，缓解听力下降。     

长链非编码RNA KCNIP4-IT1通过靶向miR-181c-5p对喉癌细胞增殖和迁移的影响

目的　探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）KCNIP4-IT1/miR-181c-5p分子轴对喉癌TU177细胞增殖和迁移的调控作用。方法　采用qPCR检测30对喉癌组织和癌旁组织、喉癌细胞系（TU159、TU686、AMC-NH-8、TU177、TU138）和支气管上皮细胞系（16HBE）中KCNIP4-IT1表达水平。通过RNA干扰技术将KCNIP4-IT1的小干扰RNA转染到TU177细胞（si-KCNIP4-IT1组），建立KCNIP4-IT1低表达细胞系，另设置阴性Ctrl组（Ctrl组，转染阴性对照序列）。MTT法、划痕愈合实验检测敲低KCNIP4- IT1后TU177细胞增殖和迁移的变化。双荧光素酶报告基因实验验证KCNIP4-IT1与miR-181c-5p之间的靶向调控关系。qPCR检测细胞中miR-181c-5p和人纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE1）mRNA的表达水平。Western blotting检测细胞迁移蛋白（β-catenin、N-Cadherin）和增殖蛋白（CDK3、PCNA）的表达水平。结果　KCNIP4-IT1在喉癌组织中表达水平高于癌旁组织（t =9.297，P<0.01）。KCNIP4-IT1在喉癌细胞系中表达水平高于16HBE细胞（t分别为4.620、7.502、4.944、8.665、9.139，P 均<0.01），以TU177细胞中KCNIP4-IT1表达水平最高（F =17.819，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1显著抑制TU177细胞增殖（P 均<0.05）和迁移（t=3.740，P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实KCNIP4-IT1靶向调控miR-181c-5p（t=5.838，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1明显上调miR-181c-5p的表达水平（t=6.214，P <0.01），下调SERPINE1基因的表达水平（t =8.190，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1明显下调细胞迁移蛋白（β-catenin、N-Cadherin）和增殖蛋白（CDK3、PCNA）的表达水平。结论　KCNIP4-IT1在喉癌组织和细胞系中呈高表达状态，敲低KCNIP4-IT1抑制喉癌TU177细胞的增殖和迁移，其分子机制可能与靶向调控miR-181c-5p并抑制SERPINE1表达有关。     

蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探讨蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对人喉癌细胞系Hep-2增殖和凋亡的影响。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA-hHlneo-CK2及非特异性表达质粒psiRNA-hH1 neo-cont，分别用脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应、Western Blot技术检测转染后蛋白激酶CK2αmRNA和蛋白表达，采用四甲基偶氮唑蓝法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况，流式细胞术检测转染后对Hep-2细胞凋亡的影响。结果转染psiRNA-hH1 neo-CK2载体后，Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05），Hep-2细胞生长缓慢（P〈0．05），其细胞周期出现明显亚二倍体峰（P〈0．05）。结论蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调Hep-2细胞蛋白激酶CK2α的表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。     

miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖

目的 探讨miR-30-5p对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及作用机制。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞系和人视网膜内皮细胞(HRECs)中的表达。利用TargetScan数据库进行生物信息学分析并预测miR-30-5p靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-30-5p与FOXG1的3'UTR结合能力及靶向关系,qRT-PCR和Western blotting分别检测miR-30-5p对FOXG1的mRNA与蛋白表达影响。瞬时转染Y79细胞后,通过CCK8法检测各组Y79细胞的增殖。 结果 与HRECs比较,miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞中表达降低,FOXG1在视网膜母细胞瘤细胞中表达升高。生物信息学预测结果显示miR-30-5p与FOXG1存在结合位点,qRT-PCR和Western blotting显示miR-30-5p可负调控FOXG1的mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶实验结果证实miR-30-5p与FOXG1 3'UTR存在靶向关系。瞬时转染miR-30-5p可升高Y79细胞中miR-30-5p的表达水平,抑制Y79细胞的增殖活力。过表达FOXG1可逆转miR-30-5p上调对Y79细胞增殖的影响。 结论 miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖。     

长链非编码RNA膀胱癌相关转录因子1通过微小RNA-142/自噬相关蛋白7调节自噬对喉癌细胞化疗耐药的影响#br#

目的　探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）膀胱癌相关转录因子1（bladder cancerassociated transcr ipt 1，BLACAT1）在喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）细胞化疗耐药中的作用。方法　通过顺铂诱导喉癌细胞株Hep-2，建立顺铂耐药喉癌细胞模型（Hep-2/R）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞中lncRNA BLACAT1、微小RNA-142 （microRNA-142，miR-142）和自噬相关蛋白7（autophagyrelated protein 7，ATG7）mRNA的表达；Western blot检测细胞中ATG7、多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MRP1）和微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）-II/LC3-I和Beclin 1的表达；MTT实验检测细胞活力。双荧光素酶报告基因实验分别检测BLACAT1和miR-142及miR-142和ATG7之间的靶向作用。结果　Hep-2/R组细胞中lncRNA BLACAT1表达水平（3.58±0.47）显著高于Hep-2组1.00±0.06），差异有统计学意义（t =9.431，P<0.05）。Hep-2/R组细胞中miR-142表达水平（0.35±0.04）显著低于Hep-2组（1.00±0.05），差异有统计学意义（t =17.583，P<0.05）。与Vector组比较，pcDNABLACAT1组Hep-2细胞活力显著升高；与NC-siRNA组比较，BLACAT1-siRNA组Hep-2/R细胞活力显著降低。与WT-BLACAT1和NC mimic共转染组相比，WT-BLACAT1和miR-142共转染的细胞中萤光素酶活性显著降低（t =10.832，P<0.05）；与Vector组比较，pcDNA-BLACAT1组细胞中miR-142表达显著降低；与WT-ATG7和NC mimic共转染组相比，WT-ATG7和miR-142共转染的细胞中萤光素酶活性显著降低（t =8.203，P <0.05）；与NC mimic组比较，miR-142 mimic组细胞中ATG7蛋白水平均显著降低。使用自噬抑制剂3-MA处理Hep-2细胞后，pcDNA-BLACAT1显著促进自噬蛋白ATG7、LC3-II/LC3-I和Beclin 1的表达，miR-142 mimic处理后自噬蛋白水平降低。使用DDP处理Hep-2/R细胞后，BLACAT1-siRNA显著抑制Hep-2/R细胞活力和MRP1蛋白的表达，而miR-142 inhibitor逆转这一结果。结论　LncRNA BLACAT1通过miR-42/ATG7信号通路促进LSCC细胞的自噬和化疗耐药性。     

miR-182-5p调控FHIT对喉鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨miR-182-5p调控脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)对喉鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法选取喉鳞癌组织和癌旁正常组织标本各39例,将anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p载体质粒分别转染至FD-LSC-1喉鳞癌细胞中,分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、miR-NC组、miR-182-5p组;将anti-miR-182-5p质粒分别与si-NC、si-FHIT载体质粒共转染至FD-LSC-1细胞中,分别记为anti-miR-182-5p+si-NC组、anti-miR-182-5p+si-FHIT组;转染均采用脂质体法。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测喉癌组织、癌旁组织中的FHIT及miR-182-5p表达水平;蛋白质印迹(Western Blot)法检测FHIT、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR-182-5p和FHIT的靶向关系。结果与癌旁组织相比,喉鳞癌组织中miR-182-5p表达水平显著升高,FHIT表达水平显著降低。抑制miR-182-5p表达可降低细胞活性和迁移、侵袭数量,提高细胞凋亡率,降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平,提高p21、Bax、E-cadherin表达水平。miR-182-5p可靶向调控FHIT,抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用。结论抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与FHIT表达相关。     

RNAi沉默SOX2表达增强Hep-2化疗药物敏感性作用研究

目的：研究SOX2表达对人喉癌上皮细胞Hep-2化疗敏感性的影响。方法：设计合成RNAi-SOX2序列,瞬时转染Hep-2细胞,Westernblot法筛选沉默效率最好的RNAi-SOX2构建pGCsi-H1-SOX2质粒,并构建其对照质粒pGCsi-HI-NC,分别转染Hep-2细胞建立稳定沉默SOX2表达细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照细胞株psiNC-Hep-2。CCK-8法检测SOX2表达沉默对Hep-2细胞对化疗药物敏感性的影响;Hoechst染色法检测SOX2表达沉默对化疗药物诱导Hep-2细胞凋亡的影响;Westernblot法检测SOX2表达沉默对凋亡相关基因Survivin、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表达的影响。结果：成功获取SOX2表达沉默细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照psiNC-Hep-2细胞株,与psiNC-Hep-2细胞相比,psiSOX2-Hep-2中SOX2表达下降78％。SOX2表达沉默后,psiSOX2-Hep-2细胞对5-FU和紫杉醇的敏感性均增强,psiSOX2-Hep-2细胞48h的IC50值分别下降到8．12ug／ml和5．16ug／ml;同时,psiSOX2-Hep-2细胞凋亡数增多;抗凋亡基因Survivin、Bcl-2表达下降明显,凋亡基因Bax、cleaved caspase-3表达显著上升。结论：RNAi沉默SOX2表达将显著增强人喉癌上皮细胞Hep-2对5-FU和紫杉醇的敏感性。