下调血管内皮细胞蛋白激酶CK2表达对血管增殖影响的体外研究

目的 探究蛋白激酶CK2表达下调对血管内皮细胞形成新生血管的能力以及对其细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 化学合成siRNA转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs), 用RT-PCR法和Western blotting法检测细胞转染效率;MTT法检测CK2表达下调对HUVECs细胞增殖的影响;成管实验和划痕实验检测CK2表达下调对细胞成管、迁移的影响;Real-time PCR和Western blotting法检测siRNA干扰蛋白激酶CK2表达后VEGF mRNA及蛋白的表达。结果 siRNA干扰蛋白激酶CK2达到了预期干扰率75%, 蛋白激酶CK2表达下调后抑制了HUVECs增殖、成管、迁移(P<0.05), 也抑制了VEGF mRNA及蛋白的表达。结论 蛋白激酶CK2表达下调可抑制VEGF的表达及HUVECs的增殖、成管、迁移。     

蛇床子素对人鼻咽癌细胞CNE2细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨蛇床子素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响，寻找鼻咽癌综合治疗的新思路。方法  以蛇床子素不同梯度浓度处理CNE2细胞，采用MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡，RT-PCR和Western blot分别测定Bax、Bcl-2mRNA和蛋白的表达水平。结果　蛇床子素处理CNE2细胞24、48、72 h对细胞增殖均有不同程度抑制作用，且呈时间、剂量依赖性（P <0.05）。蛇床子素干预CNE2细胞48 h后，流式细胞术结果表明细胞凋亡率显著升高（P <0.01），RT-PCR与Western blot检测提示Bax mRNA、蛋白表达显著增加，而Bcl-2 mRNA及蛋白明显下调（P <0.01），均呈浓度依赖性。结论　蛇床子素对CNE2细胞具有抑制增殖和促进凋亡的生物学效应。     

SIRT1抗视网膜色素上皮细胞氧化应激作用的实验研究

目的 观察去乙酰化酶-1(SIRT1)对视网膜色素上皮细胞(RPE)氧化应激的防护作用.方法 应用50 μmol/L H₂O₂与ARPE-19细胞孵育24 h诱导RPE产生氧化应激病理生理过程,观察细胞增殖及凋亡率、细胞活性氧水平(ROS), 氧化剂诱导RPE细胞衰老状况,了解氧化应激对RPE的损伤;进一步采用SIRT1激动剂白藜芦醇(RSV)及抑制剂烟酰胺(NA)分别处理经H₂O₂干预的RPE细胞,观察SIRT1抗RPE氧化应激效果.结果 ①与对照组相比,H₂O₂干预RPE后细胞增殖显著下降(P=0.020),凋亡率及内生ROS水平均显著增高(P=0.013, P=0.040),细胞衰老水平显著升高(P=0.045);②NA可显著提高H₂O₂的毒性作用,降低RPE细胞增殖率(P=0.049),刺激凋亡(P=0.028),使ROS累积和衰老速度增加;③RSV具有显著的抗H₂O₂毒性作用;④RT-qPCR分析显示,SIRT1mRNA水平显著下调.结论 氧化应激状况下SIRT1表达下调,表明SIRT1对氧化应激诱发的视网膜色素上皮细胞损伤有显著的防护作用.适当提高SIRT1活性也许是延缓AMD的一种治疗策略.     

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。 方法 设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。 结果 与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。 结论 成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。     

白花蛇舌草多糖提取物诱导Hep-2细胞凋亡与抑制侵袭机制

目的 研究白花蛇舌草多糖提取物(HDP)对人喉癌Hep-2细胞的抗瘤作用。 方法 采用MTT测量细胞活性,流式细胞仪进行凋亡分析。Transwell培养小室进行细胞侵袭实验,Western blotting测量多糖提取物诱导凋亡和抗侵袭活性的机制。 结果 HDP对喉癌细胞的抑制呈时间和浓度依赖性,浓度越高,时间越长抑制率越高。细胞周期分析发现HDP(400 μg/mL)使细胞滞留于G₀/G₁期,同时发现药物作用24 h后细胞凋亡率明显升高,Western blotting结果分析发现相关凋亡蛋白caspase-3, caspase-8和caspase-9表达升高,而Bcl-2表达下降。同时细胞侵袭实验还发现HDP抑制喉癌细胞的侵袭,抑制MMP-2和uPA相关蛋白的表达。 结论 研究发现 HDP 抑制喉癌细胞的凋亡和侵袭,对恶性肿瘤的治疗有潜在的应用价值。     

塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2特异抑制剂--塞来昔布对喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及可能机制。方法 以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响, Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞核的形态改变,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax及COX-2的表达, Western blot分析Caspase-3裂解激活。结果 MTT结果表明塞来昔布抑制Hep-2细胞的增殖呈时间和浓度依赖;Hoechst33342 荧光染色见随塞来昔布处理时间延长,细胞核逐渐出现凝集、碎裂等凋亡表现;流式细胞术检测细胞凋亡率见塞来昔布处理细胞24h, 70、100μmol/L组凋亡率分别为(28.9±2.74)%、(32.7±3.96)%;Western blot分析蛋白表达,见随药物处理浓度增加,COX-2、Bcl-2表达降低,Bax表达增加,随药物处理时间延长Caspase-3出现裂解片段。结论 塞来昔布能够有效地抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与Bax／Bcl-2比值升高,Caspase-3蛋白裂解激活有关。     

EGCG对鼻咽癌细胞株CNE-2及相关基因表达的影响

目的:研究EGCG对鼻咽癌细胞系CNE-2的增殖与凋亡作用,探讨其对细胞增殖与凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法:应用MTT实验、流式细胞仪检测细胞的增殖与周期;Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡;RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。结果:EGCG明显抑制CNE-2细胞的增殖,诱导其凋亡,该作用具有剂量-效应关系。EGCG抑制CNE-2细胞Bcl-2表达,诱导CNE-2细胞Bax、Caspase-3表达。结论:EGCG在体外具有抗鼻咽癌细胞的作用,此作用可能是通过调节细胞增殖与凋亡基因的表达实现的。     

17-AAG联合EGCG对人鼻咽癌细胞株增殖和凋亡的影响及机制研究

目的　研究17-烯丙胺-17-去甲氧基格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）单药或联合使用对人鼻咽癌细胞CNE的凋亡诱导作用,寻找鼻咽癌治疗的新方向。方法　MTT法和荧光染色分别检测CNE增殖抑制率及细胞形态的变化;RT-PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。结果　①17-AAG、EGCG单独作用于CNE细胞24、48、72 h,均有抑制作用,与时间和剂量相关（P＜0.01）;两者联合抑制作用显著增 加,且表现出时间、剂量依赖性（P＜0.01）。②RT-PCR检测联合用药时Caspase-3和Bax的mRNA表达明显高于单独用药组,Bcl-2 mRNA明显低于单独用药组。结论　17-AAG联合EGCG可显著抑制CNE细胞增殖,其可能与上调Bax和Caspase-3的表达发挥其抗鼻咽癌细胞的生长增殖作用。     

miR-204通过内质网应激抑制视网膜母细胞瘤生长作用及机制的研究

目的 探讨miR-204在视网膜母细胞瘤中的表达、对其生长的作用及其分子机制。 方法 通过RT-PCR检测miR204 在视网膜母细胞瘤(Y79)及正常视网膜细胞(ARPE-19)中的表达,并用miR-204 模拟物及抑制物转染Y79 细胞,CCK-8 及流式细胞仪检测Y79 细胞的生存率及凋亡情况, Western blot 法检测GRP78蛋白的表达。 结果 miR-204在视网膜母细胞瘤Y79细胞中呈现低表达,可显著抑制视网膜母细胞瘤的增殖,促进其凋亡,可上调 GRP78蛋白的表达,激活内质网应激途径。 结论 miR-204在视网膜母细胞瘤细胞中表达下调,miR-204可能通过激活内质网应激介导的调亡途径诱导视网膜母细胞瘤细胞发生凋亡。     

Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用

目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene）表达对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高（F=547.525,P均〈0.001）;miR-16-1表达增高（F=99.979,P均〈0.001）;Bcl-2 mRNA表达无明显差别（F=0.220,P〉0.05）;Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。     

紫杉醇诱导喉咽癌耐药细胞株的生物学特性

目的 研究人喉咽癌细胞株FaDu与其耐药株FaDu/T在生物学特性方面的异同及内在联系.方法 以喉咽癌FaDu细胞为亲本,通过紫杉醇(Taxol)递增法筛选出其耐药细胞株FaDu/T.MTT法检测其耐药性,流式细胞术检测其周期,吖啶橙和Hoechest 33342/PI染色法检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Wester...     

白藜芦醇对KBv200细胞多药耐药逆转作用的研究

目的 探讨白藜芦醇对人口咽腔上皮癌KBv200耐药细胞株的多药耐药逆转作用及可能的逆转机制.方法 采用四甲基偶氮唑盐比色法检测KBv200耐药细胞中白藜芦醇对长春新碱、多柔比星和紫杉醇的逆转倍数,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测每组KBv200细胞中肿瘤多药耐药相关基因1(multidrug resistance 1,MDR1)和B细胞淋巴瘤基因2(Bcl-2)mRNA和蛋白水平的表达.结果 白藜芦醇对化疗药物具有协同增效作用,显著逆转KBv200耐药性.200 umol/L白藜芦醇对长春新碱、紫杉醇和多柔比星(阿霉素)的逆转倍数达到77.1、61.3和5.9.白藜芦醇能显著降低Bcl-2、MDR1mRNA和蛋白的表达,100 umol/L、200 umol/L白藜芦醇处理组与未加白藜芦醇组的MDR1、Bcl-2mRNA表达差异均有统计学意义(t值分别为2.98、3.51和3.12、4.56,P值均<0.05).结论 白藜芦醇对口咽腔上皮癌耐药细胞具有耐药逆转作用,该逆转作用可能是通过降低耐药基因表达、促进细胞凋亡实现的.     

miR-182-5p调控FHIT对喉鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨miR-182-5p调控脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)对喉鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法选取喉鳞癌组织和癌旁正常组织标本各39例,将anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p载体质粒分别转染至FD-LSC-1喉鳞癌细胞中,分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、miR-NC组、miR-182-5p组;将anti-miR-182-5p质粒分别与si-NC、si-FHIT载体质粒共转染至FD-LSC-1细胞中,分别记为anti-miR-182-5p+si-NC组、anti-miR-182-5p+si-FHIT组;转染均采用脂质体法。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测喉癌组织、癌旁组织中的FHIT及miR-182-5p表达水平;蛋白质印迹(Western Blot)法检测FHIT、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR-182-5p和FHIT的靶向关系。结果与癌旁组织相比,喉鳞癌组织中miR-182-5p表达水平显著升高,FHIT表达水平显著降低。抑制miR-182-5p表达可降低细胞活性和迁移、侵袭数量,提高细胞凋亡率,降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平,提高p21、Bax、E-cadherin表达水平。miR-182-5p可靶向调控FHIT,抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用。结论抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与FHIT表达相关。     

Expression of cell proliferation and apoptosis gene associated protein on nasal polyps and its significance]

OBJECTIVE: To further understand the pathogenic mechanism of nasal polyps, namely the cells proliferation and apoptosis in nasal polyps tissue. METHODS: The proliferation cell nuclear antigen (PCNA), apoptosis associated gene protein (Bcl-2, Bax) were determined in 26 tissue samples of nasal polyps and 14 controls from normal inferior turbinates respectively. RESULTS: (1) The positive expression e of PCNA, Bcl-2 and Bax were significantly higher in epithelium of nasal polyps than the controls, and the expression rate of Bcl-2/Bax, however, tended equipoise. (2) The expression of Bcl-2 were significantly stronger than Bax in glands, eosinophils of nasal polyps tissue, and there were not significant differences in inferior turbinates. CONCLUSION: There is strongly proliferation activity in the epithelium of nasal polyps, and expression imbalance of Bcl-2/Bax may be one of the important factors of eosinophilia in nasal polyps tissue.     

白细胞介素-24对喉癌细胞的增殖抑制效应及机制

目的：研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（Ad—mda-7／IL-24）基因对喉癌细胞Hep-2增殖抑制效应及机制。方法：将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以正常人脐静脉内皮细胞HUVEC为对照,采用RT-PCR方法检测Hep-2、HUVEC细胞中外源性hIL-24表达,以及Bcl-2和Bax的变化;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的生长和凋亡情况。结果：腺病毒介导的hIL-24mRNA能在Hep-2细胞和HuVEC细胞中表达;在Hep-2细胞中,抗凋亡分子Bcl-2表达降低,而促凋亡分子Bax表达增强;在HUVEC细胞中Bcl-2表达没有变化,Bax表达有所增强。MTT法显示Ad—hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长。在Hep-2细胞中,显微镜下可见明显的细胞凋亡。结论：Ad—hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

靶向血小板衍生生长因子-B siRNA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的探讨血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)B链mRNA的siRNA质粒转染喉癌细胞株Hep-2细胞,沉默Hep-2细胞中PDGF-B mRNA并检测细胞增殖。方法以脂质体lip2 0 0 0为载体,设计4组针对PDGF-B的siRNA片段瞬时转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR、Westernblot分别检测各组PDGF-B mRNA、PDGF-B蛋白的表达及干扰效果,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,并与阴性对照组和空脂质体组进行比较。结果实时荧光定量PCR检测显示:SiRNA2、SiRNA3、SiRNA4组PDGF-B mRNA表达均有明显抑制,其中SiRNA2抑制率最高;与SiRNA1、阴性对照组及空脂质体组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3组PDGF-B mRNA蛋白表达均有下降,其中SiRNA-2下降最明显,而SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组对PDGF-B蛋白表达无明显抑制作用。MTT法检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3均明显抑制Hep-2细胞增殖,其中SiRNA-2对Hep-2细胞的抑制作用最明显;且与SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功运用siRNA干扰喉癌Hep-2细胞PDGF-B mR-NA,靶向沉默PDGF-B mRNA能有效抑制细胞增殖。     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。