人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

目的探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记。方法人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton’s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代。将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况。利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原。结果经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一。人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代。经冷冻保存,复苏后仍能较好生长。人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达。结论人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源。     

Isolation,culture and detection of molecular marker of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and umbilical cord

目的 探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记.方法 人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton＇s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代.将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况.利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原.结果 经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一.人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代.经冷冻保存,复苏后仍能较好生长.人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达.结论 人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源.     

兔膀胱移行上皮细胞的培养和鉴定

目的建立一种有效、简便的兔膀胱上皮细胞体外原代培养方法。方法以DMEM：F12为基础培养基，添加10％胎牛血清（fetal bovine serum，FCS）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）等营养成分，在37℃、5％CO2的孵箱内培养，观察细胞形态变化及生长、增殖过程，并进行免疫荧光鉴定。结果细胞在第10～14d融合形成单层，细胞形态呈多角形的铺路石子状，经免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。结论此培养方法能在短时间内获得大量移行上皮细胞，为进一步采用组织工程技术构建尿道提供种子细胞，为治疗重度尿道下裂、尿道下裂残废和较长的后尿道狭窄等顽症提供依据。     

应用组织工程技术体外构建泌尿系细胞-支架复合结构

目的 探讨应用组织工程技术体外构建泌尿系细胞支架复合结构的可行性.方法 取健康处死猪的膀胱黏膜下层,经过物理和化学方法处理后形成膀胱黏膜下层无细胞基质,进行组织学和细胞毒性检测;收集原代兔膀胱尿路上皮细胞以及平滑肌细胞,经过体外培养扩增后分别接种于无细胞基质的两侧面,HE和免疫组织化学染色观察细胞在基质中的生长、粘附和扩增情况.结果 两种细胞可分别在膀胱黏下层无细胞基质的两侧面生长扩增,平滑肌细胞可向基质内部侵入.结论 膀胱无细胞基质适合膀胱平滑肌细胞及尿路上皮细胞生长,体外可形成类似膀胱壁的复层细胞组织工程结构.     

免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的可行性.方法 采用免疫磁珠细胞分选法去除羊水细胞中CD44和SSEA4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿干细胞间接得到分离,体外培养扩增后,观察细胞生长特性,免疫荧光染色计算OCT-4阳性胎儿干细胞得率,Real-TimePCR比较分离前后OCT-4表达量的差异,免疫组化检测NANOG、AKP、MAP-2、NGFR和Myosin等细胞因子的表达.结果 经免疫磁珠分离的细胞接种12h内贴壁生长,形态呈梭形,部分呈多角形,融合后形成辐射状排列.免疫荧光染色OCT-4阳性细胞得率为(90.15±8.25)%,Real-TimePCR检测结果显示分离后细胞OCT-4的表达量较未分离细胞和MSC有显著性差异(P＜0.01).原代培养可获得(1～2)×107个细胞,3代可获得(2～4)×108个细胞,传至10代以后细胞的增殖能力下降.免疫组化结果显示OCT-4阳性胎儿干细胞表达NANOG、AKP、MAP-2和NGFR等细胞因子.结论 免疫磁珠细胞分选法可以从羊水中分离出OCT-4阳性的胎儿干细胞,分离后的细胞保持干细胞原有特性及生物学特征,可作为组织工程种子细胞.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养改良方法的研究

目的 改进大鼠大脑皮质星形胶质细胞(astrocyte, AS)的体外培养方法,为进一步研究奠定基础.方法 选取生后3 d的Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层,常规分离纯化AS,低密度种植,培养箱中孵育1 h后换瓶,24 h后换液,细胞融合成单层后传代,传代后维持在含10%胎牛血清DMEM培养基中培养,并在长时期内不给予更换或补加培养液.采用 GFAP/DAPI免疫荧光法鉴定AS细胞.结果 体外培养的纯化大鼠大脑皮层AS,表现为细胞突起细长、胞体明显缩小、形态多样的纤维型AS,最后细胞突起之间相互连接形成AS网络.GFAP/DAPI免疫荧光染色结果示GFAP阳性细胞达98%以上.结论 大鼠大脑皮质AS的体外培养改良方法培养的AS体外形态、发育特点均与在体内AS基本一致,且纯度较高,为进一步进行AS的研究创造了条件.     

新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养与鉴定

目的 探讨新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养及鉴定方法 ,为早产儿肺损伤体外研究提供实验手段.方法 取出生24 h内新生Wistar大鼠肺组织,用胰酶和胶原酶消化,经离心和免疫吸附法纯化后培养.采用透射电镜和免疫荧光技术进行鉴定.结果 体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞18～24 h贴壁,呈多角形,岛状生长.培养24～48 h细胞体积增大,胞浆内颗粒明显,72 h后细胞内颗粒减少,6～7 d细胞失去正常形态.透射电镜可见特异性结构板层小体,免疫荧光可见表面活性蛋白C表达.结论 该方法 是一种有效分离和纯化新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法 ,可用于肺泡Ⅱ型上皮细胞功能及早产儿肺损伤的体外研究.     

孕中期羊水来源胎儿间充质干细胞体外诱导为平滑肌细胞的研究

目的探讨孕中期羊水来源的胎儿间充质干细胞（MSC）体外诱导为平滑肌细胞的可能性。方法通过超声引导下羊膜腔穿刺获取人孕18～22周羊水，分离细胞，体外培养传代，机械方法挑取MSC克隆，体外扩增，流式细胞仪检测MSC表面抗原表达，以0．01ng／ml、0．1ng／ml、1ng／ml和10ng／ml浓度的转录生长因子B（TGF-β）分别诱导第3代Msc28d，免疫组化染色检测各浓度TGF-β诱导后a—Actin在细胞内表达情况，透射电镜观察1ng／mlTGF-β诱导28d后细胞内肌丝含量，激光共聚焦显微镜测定该浓度组细胞在乙酰胆碱刺激下细胞内液钙离子浓度的变化。结果羊水来源的胎儿MSC在体外培养体系中增殖迅速，流式细胞仪检测结果显示CD44表达阳性，CD34、CD45和HLA—DR阴性。经1ng／mlTGF-β诱导28d后，细胞形态呈长梭形平滑肌样，融合后细胞分布形成特征性的“峰”和“谷”状，同时表达平滑肌细胞特异性蛋白标志α—Actin，细胞内出现黑色棒状肌丝，激光共聚焦显微镜显示该浓度TGF-β诱导后细胞内液钙离子基础值明显高于未诱导的细胞，在乙酰胆碱刺激下，细胞内液钙离子呈波峰样释放。结论羊水来源的胎儿MSC在体外可以定向分化为平滑肌细胞。     

儿童松质骨成骨细胞体外培养

目的 探讨儿童松质骨成骨细胞体外培养条件，为儿童骨组织工程研究选择种子细胞。方法 均取自先天性髋脱位患儿加盖手术时多余髂骨，术前证实患儿无代谢性骨病，未服激素类等药物。取材在手术时进行，男1例，女3例，年龄3～7岁。骨块保持无菌，置于无血清培养液中，4℃冰箱存放，2～4h内分离骨细胞。将髂骨松质骨剪碎成骨粒，经胰蛋白酶初步消化后，采用胶原酶Ⅱ分次消化法，获取原代成骨细胞，将原代成骨细胞置于含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养，经传代、纯化后，绘制细胞生长曲线。成骨细胞的鉴定采用改良Goraori碱性磷酸酶(ALP)钙钴法染色、ABC法Ⅰ、Ⅲ型胶原染色及放射免疫法测定骨钙素含量。培养期间应用倒置相差显微镜观察细胞形态。结果经酶消化法得到的儿童成骨细胞，呈梭形，较饱满。原代细胞胞体较小，传代后可呈多角形、梭形或不规则形，胞浆内可出现黑色颗粒。ALP染色阳性率45％。初次酶消化后的松质骨块经培养后，还可以多次消化得到更加纯化的成骨细胞。结论 采用胰蛋白酶及胶原酶的多次消化法获取原代细胞，经培养、传代后，可得到较为稳定、纯化的儿童松质骨成骨细胞。     

Galectin-7在哮喘患儿支气管上皮细胞凋亡中的作用

目的 了解Galectin-7在哮喘息儿支气管上皮细胞凋亡中的作用。方法 经纤维支气管镜获得哮喘与非哮喘对照儿童的支气管黏膜,采用组织块培养方法进行支气管上皮细胞的培养,将RSV感染支气管上皮细胞,应用Microarray分析哮喘与非哮喘对照儿童支气管上皮细胞在RSV感染后表达有差异的基因;经GeneBank查询确定,这些差异基因中与凋亡有关的基因为Galectin-7。随后选取10例哮喘儿童和17例非哮喘对照儿童的支气管黏膜,应用原位末端标记法（TUNEL法）、原位杂交和免疫组化方法,分别对支气管上皮细胞凋亡、上皮细胞中Galectin-7及其mRNA表达进行观察。结果 哮喘儿童支气管上皮细胞在RSV感染后Galectin-7基因上调8倍,哮喘儿童较非哮喘对照儿童支气管上皮细胞中Galectin-7以及mRNA表达增加,凋亡也同时增加。结论 Galectin-7可能与哮喘息儿支气管上皮细胞的凋亡有关。Galectin-7可能通过这一作用,参与哮喘发病。