人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

抑瘤素M在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

目的：构建抑瘤素M（oncostatinM,OSM)的酵母表达体系,方法：将人OSM cDNA连入pPIC9K酵母表达载体,转染毕赤酵母（Pichia pastoris),用MD和MM营养缺陷型培养基筛选具有正确表型的重组转化子,用RNA印迹法和蛋白质印迹法鉴定母转化菌株中OSMmRNA转录和OSM相对分子质量。MTT法鉴定OSM蛋白对人黑素瘤细胞生长的抑制活性。结果：构建的毕赤酵母体系可实现人OSM分泌表达,表达量占外分泌蛋白的70％以上,表达蛋白相对分子质量约30000,对黑素瘤细胞生长可产生明显抑制作用。结论：OSM的酵母分泌表达体系表达量可观,表达蛋白集中于培养液上清,便于纯化,是日后进行OSM大规模制备的可行途径。     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化毕赤酵母中的表达

目的在糖基工程化毕赤酵母中表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白（tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc）,考察糖基工程化过程对其活性的影响。方法将编码TNFR-Fc的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA中,构建重组表达质粒pPIC6-TF。用表达质粒转染N-糖基化工程改造的毕赤酵母菌株GSB,在含有杀稻瘟菌素的YPD平板上进行筛选。然后再使用HRP标记的羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行斑点印迹（dot-blot）筛选。选择表达量较高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57进行高密度培养,通过Protein A亲和层析从发酵上清中纯化融合蛋白,利用鼠L929细胞对融合蛋白的抗TNFα活性进行分析。结果通过筛选获得了表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达菌株,纯化后的TNFR-Fc融合蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型毕赤酵母表达产物,而低于哺乳动物细胞的表达产物。结论糖基化改造改善了人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的抗TNFα活性,但必须进行进一步的改造才可能获得与哺乳动物细胞表达产物相似的活性。     

耐辐射奇球菌PprI蛋白质在毕赤酵母菌中的高效表达及纯化

目的 利用真核毕赤酵母高效表达原核的耐辐射奇球菌pprI基因,建立高效表达及纯化PprI蛋白质的技术路线。方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,改造耐辐射奇球菌pprI基因的编码序列,利用PCR技术全合成改造过的pprI基因,并在其N末端添加一个6×His标签。PCR产物经纯化后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM-905A中,利用Cop I和Not I双酶切并回收线性化的目的片段后,转化毕赤酵母GS115菌株。将获得的毕赤酵母转化子诱导表达,SDS-PAGE、Western blot和质谱检测培养上清液,用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,BCA法测定蛋白浓度。结果 新合成的耐辐射奇球菌pprI基因编码序列正确,毕赤酵母转化菌株的培养上清液经SDS-PAGE和Western blot均可检测到相对分子质量为43000的目的蛋白条带,经质谱检测证实该目的蛋白为耐辐射奇球菌PprI蛋白。选用Ni-NTA柱获得了大量纯化的PprI蛋白,应用浓度为250 mmol/L的咪唑淋洗时,PprI蛋白洗脱率最高。BCA法测得纯化蛋白浓度为0.35 mg/ml。结论 建立了一种新的适于毕赤酵母表达的耐辐射奇球菌pprI基因,成功构建了分泌表达PprI蛋白质的重组毕赤酵母工程菌株,建立了高效表达目的蛋白的技术路线,并获得了高效表达和纯化的PprI蛋白。     

长链胰岛素样生长因子1在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

目的:在毕赤酵母KM71中分泌表达长链-Arg3-胰岛素样生长因子1(LR3IGF-1),并探讨其体外生物活性.方法:人工合成LR3IGF-1基因,构建表达载体pCαA-LR3IGF-1,转化毕赤酵母KM71.筛选重组工程菌株,经诱导表达并从上清中纯化目的蛋白,鉴定其生物活性.结果:诱导上清中存在一8×103 左右的条带,经初步鉴定为目的蛋白条带.每升培养基经纯化后能得到40 mg目的蛋白.纯化后的目的蛋白具有明显的体外刺激NIH 3T3细胞增殖的作用.结论:建立了LR3IGF-1在毕赤酵母 KM71中表达及纯化方法,该方法能获得具有生物学活性的高纯度LR3IGF-1,为LR3IGF-1的后续研究及临床应用奠定了基础.     

人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定

目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,在变性条件下纯化包涵体,经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体,表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体,经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白,为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。     

分泌表达rhOPG-HSA融合蛋白的毕赤酵母菌株的构建

目的：将骨保护素（osteoprotegerin,OPG）与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）基因融合,以构建高效分泌表达的巴斯德毕赤酵母菌株。方法：通过RT-PCR扩增OPG基因,构建pHILD2-HSA-OPG质粒,并对HSA-OPG分泌表达产物进行了ELISA检测。结果：pHILD2-HSA-OPG表达质粒经鉴定与测序证明正确,并在毕赤酵母GS115中能够实现较高表达。结论：成功构建了高效分泌表达重组骨保护素融合蛋白（rhOPG-HSA）的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)在巴斯德毕赤酵母中表达与纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中进行表达及纯化AT Ⅲ ,以对其功能进行深入研究。方法 :将携带AT Ⅲ基因的表达载体电转染GS115细胞 ,用G4 18筛选抗性克隆 ,SDS PAGE与Western印迹检测及鉴定表达产物 ;采用生化法测定AT Ⅲ的表达量 ;利用凝血酶空斑法测定表达产物活性 ,经过Heparin hyperD柱纯化。结果 :Western印迹分析发现转移至膜上的表达产物能与抗AT Ⅲ单克隆抗体结合 ,证明成功地表达了AT Ⅲ ,纯度 >95 %。活性测定表明表达产物具有天然AT Ⅲ的生物活性。结论 :在巴斯德毕赤酵母中成功地表达与纯化AT Ⅲ ,得到同天然蛋白相似的比活性人AT Ⅲ。     

重组人sIL-2Rα在HEK293细胞中的分泌性表达与鉴定

目的在HEK293细胞瞬时表达带有组氨酸标签的重组人sIL-2Rα的胞外功能区片段,并进行纯化与鉴定。方法对GenBank中IL-2Rα膜外区基因序列进行优化,并在3′端融合组氨酸标签序列的基因,人工合成该基因并将其克隆到表达载体pL-293;转染HEK293细胞瞬时表达sIL-2Rα;表达产物His标签纯化;SDS-PAGE和Western印迹对表达产物进行鉴定。结果表达产物中在相对分子质量为48 000处可见与目的蛋白相对分子质量相符的条带,该条带可被sIL-2Rα单克隆抗体识别。结论构建的重组sIL-2Rα质粒能够在HEK293细胞瞬时表达,表达量为1~1.5 mg/L。     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

人GDNF-TAT真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：在毕赤酵母中表达带有TAT多肽的人胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotro-phic factor,GDNF）,为探讨GDNF-TAT用于帕金森病的治疗奠定基础。方法：用密码子优化法合成人GDNF基因序列连在pPICZαA,用PCR方法分别在上游引入TAT位点与XbaⅠ酶切位点,下游设计扩增pPICZαA上的α-因子序列。然后插入pPICZαA载体中,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切并测序鉴定,构建GDNF-TAT在毕赤酵母表达质粒pPICZαA-GDNF-TAT。电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-GDNF-TAT后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和432bp片段,表明目的片段已插入载体中,经序列测定其含有完整的GDNF-TAT基因片段,Western印迹结果显示含有pPICZαA-GDNF-TAT的毕赤酵母GS115能分泌表达GDNF-TAT。结论：成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-GDNF-TAT,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达GDNF-TAT。     

甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。     

甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）;进而利用巨噬细胞（macrophage,MR）表面的甘露糖受体（mannose receptor,MR）将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）,观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor,MMR）的竞争性配体甘露聚糖（mannan）的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量（Mr）为（66～97）×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F（PNGaseF）酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。     

EBOV三聚体糖蛋白在新型糖基工程酵母中的表达与纯化

目的 用新型糖基工程酵母表达并纯化得到具有类似哺乳动物细胞糖基化修饰的埃博拉病毒三聚体糖蛋白(EBOV-GP),为其亚单位疫苗研究提供基础.方法 人工合成EBOV-GP基因,将编码全长EBOV-GP基因和编码缺失黏蛋白样域(MLD)与穿膜区的EBOV-GPΔMLDΔTM基因分别克隆到pPICZ-αA载体上,电转化糖基工程酵母,与在HEK-293T细胞中表达的EBOV-GP进行比较,利用PNGaseF和EndoH酶切分析其糖基化修饰,利用亲和层析与离子交换层析纯化目的蛋白,蛋白质N端测序分析其在蛋白翻译修饰过程中是否正确切除了信号肽,同时利用凝胶柱分析是否能形成三聚体结构.结果 PNGaseF酶切结果显示,用糖基工程酵母和HEK-293T细胞表达的EBOV-GP糖蛋白相对分子质量大小与N-糖基化程度均一致,EndoH酶切显示EBOV-GPΔMLDΔTM的N-糖基化修饰是非高甘露糖形式的复杂型糖基化修饰;经三步纯化得到的目的蛋白,N端测序显示为GP蛋白成熟肽序列,其自身信号肽被正确切除;凝胶柱分析显示纯化得到的目的蛋白以三聚体形式存在.结论 用糖基工程酵母表达制备了具有复杂型糖基化修饰的EBOV-GP.     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达

目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

感觉神经元特异性受体rMrgD基因的克隆与表达

目的克隆rMrgD基因并于HEK293细胞中表达。方法利用聚合酶链反应技术,从总RNA中扩增出目的基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达rMrgD载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株。通过免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定。结果直接和间接免疫荧光实验皆表明rMrgD主要定位于细胞膜上,Western印迹检测证实rMrgD在HEK293细胞主要以单体和二聚体形式存在。结论含有rMrgD基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上。本研究为进一步探究rMrgD受体的功能奠定了基础。