MEBO对糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2动态表达的影响

目的 探讨分析湿润烧伤膏（MEBO）对糖尿病溃疡大鼠创面组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）及基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）表达水平的影响。方法 从160只健康雄性SD大鼠中随机选取120只制备大鼠糖尿病模型,其余40只正常喂养;最终选取90只造模成功大鼠随机分为模型组、MEBO组与bFGF组,每组30只,与此同时随机选取未予特殊处理的30只大鼠作为空白组,所有大鼠均做全层皮肤缺损创面,空白组与模型组大鼠创面予以凡士林油纱换药处理、MEBO组大鼠创面予以MEBO药纱换药处理、bFGF组大鼠创面予以重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF）药纱换药处理,对比观察各组大鼠干预第4、6、12天时创面愈合率以及MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2与胶原蛋白水平变化情况。结果 （1）干预第4、6、12天,模型组大鼠创面愈合率均明显低于其他各组（P均＜0.05）,空白组大鼠创面愈合率均明显高于其他各组（P均＜0.05）,而MEBO组与bFGF组间无明显差异（P均＞0.05）。（2）干预第4、6、12天,模型组大鼠创面组织中MMP-9及MMP-2 mRNA表达水平均明显高于其他各组（P均＜0.05）,TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达水平均明显低于其他各组（P均＜0.05）;除干预第6天MEBO组大鼠创面组织中TIMP-1 mRNA表达水平明显高于bFGF组（P＜0.05）外,其余各时间点MEBO组与bFGF组大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达水平均无明显差异（P均＞0.05）。（3）干预第4、6、12天,模型组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显低于其他各组（P均＜0.05）;除干预第4天MEBO组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显高于bFGF组（P＜0.05）外,其余各时间点MEBO组与bFGF组大鼠创面组织中胶原蛋白水平均无明显差异（P均＞0.05）。结论 MEBO可通过调控糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的表达水平改善胶原蛋白过度降解,维持细胞外基质代谢平衡,进而促进创面愈合,调节MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2的比例失衡可能是其促进糖尿病溃疡创面愈合的作用靶点。     

Toll样受体4及核因子-κB在脂多糖诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9表达中的作用

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)和核因子(NF)-κB在脂多糖(LPS)诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达中的作用,观察TLR4抑制剂TAK-242对MMP-9表达的影响.方法 以终浓度为0、0.1、l、10、100μg/L的LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24h,或以LPS(终浓度10μg/...     

负压封闭引流联合湿润烧伤膏序贯治疗骶尾部Ⅲ期压疮临床分析

目的分析探讨负压封闭引流联合湿润烧伤膏序贯治疗骶尾部Ⅲ期压疮的应用效果及部分作用机制。方法选取2017年8月至2019年8月郑州大学第三附属医院收治的84例骶尾部Ⅲ期压疮患者作为研究对象,并按照随机数表法将其随机分为观察组与对照组,其中观察组患者采用负压封闭引流联合湿润烧伤膏序贯治疗局部创面,对照组患者单纯采用负压封闭引流治疗局部创面,对比两组患者创面愈合时间及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)与基质金属蛋白酶抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的变化情况。结果治疗第3天,观察组患者MMP-9、TIMP-1表达水平明显高于对照组(t=7.053、5.479,P均=0.000),而治疗第7、14天,观察组患者MMP-9、TIMP-1表达水平均明显低于对照组(第7天:t=7.378、9.438,P均=0.000;第14天:t=22.300、26.790.P均=0.000);观察组患者创面愈合时间明显短于对照组(t=2.652,P=0.010)。结论负压封闭引流与湿润烧伤膏序贯治疗可有效促进骶尾部Ⅲ期压疮创面愈合,且调节MMP-9及TIMP-1的表达水平可能是其部分作用机制。     

4 Gy X线照射通过上调MMP-2/9表达增强骨肉瘤细胞迁移能力

目的 研究4 Gy X线照射对骨肉瘤细胞迁移能力的影响及其机制.方法 将143B细胞和U2OS细胞分为对照组和4 Gy照射组,分别于照射后12、24、36和48 h,采用Transwell法检测细胞的迁移能力,Western印迹检测细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平;siRNA法干扰细胞MMP-2/MMP-9表达.结果 与对照组相比,4 Gy X线照射后,143B细胞和U2OS细胞12和48 h的迁移能力未发生显著变化(P>0.05),24和36 h的迁移能力均显著增强(P<0.05);同时,两种细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平在12和48 h无显著变化(P>0.05),在24及36 h显著升高(P<0.05);干扰143B细胞和U2OS细胞中的MMP-2/MMP-9表达后,两种细胞的MMP-2/MMP-9蛋白表达水平及迁移能力均明显降低(P<0.05).结论 4 Gy X线照射可通过上调MMP-2/MMP-9表达水平增强143B细胞和U2OS细胞的迁移能力.     

脂多糖对成纤维细胞基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子表达的影响

目的观察脂多糖（LPS）对成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制物金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）表达的变化，探讨伤口感染时LPS对伤口愈合的可能影响。方法将体外培养的人成纤维细胞加入不同浓度的LPS（10、100、1000μg／ml后，用荧光标记的明胶酶谱法和反向酶谱法测定培养液中MMPs及TIMPs表达的变化，并用电泳分析软件对黑色条带（MMPs）或亮色条带（TIMPs）的面积及密度进行半定量分析。结果LPS可以上调成纤维细胞的MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的表达，且TIMPs增加的程度大于MMPs。10、100、1000μg／ml的LPS使MMP-2分别增加为基值的1．3、1．7、1．6倍，TIMP-1分别为3、4．5、3．5倍，TIMP-2分别为3、6、5．6倍。结论LPS在伤口愈合过程中成纤维细胞表达MMPs和TIMPs的环节上，对伤口愈合没有明显的不利影响。     

人肠上皮细胞内毒素低反应性及其机制探讨

为探讨人正常肠上皮细胞对内毒素（LPS）刺激低反应性的机制，用ELISA法检测LPS刺激肠上皮细胞18h后IL－8的分泌水平，用RT－PCR及RPA法检测肠上皮细胞LPS跨膜信号转导相关受体TLR4，TLR2，CD14和MD2 mRNA的表达及LPS刺激对其表达的影响，结果表明：LPS刺激不能引起肠上皮细胞IL－8的分泌，而IL－1β刺激却能引起其分泌；人正常肠上皮细胞TLR4，TLR2，CD14和MD2mRNA的表达均较弱，LPS刺激后，TLR4，CD145 CD14和MD2 mRNA表达进一步降低，而TLR2的表达无显著变化，说明肠上皮细胞对LPS的低反应性与细胞表达LPS相关受体低表面有一定的内在联系，从而进一步证实TLR4，CD14，MD2在介导LPS跨膜信号转导中起重要作用。     

低能量激光照射对脂多糖介导人牙周膜成纤维细胞炎性损伤的保护作用

目的:研究低能量激光照射(low level laser irradiation,LLLI)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)炎性损伤的影响及机制。方法:将hPDLFs接种于孔板中,随机分为正常组和LPS组以及LPS+LLLI组。正常组细胞行常规培养基培养,LPS组及LPS+LLLI组在加入1 mg/1 LPS培养基中培养24 h,LPS+LLLI组3个亚组分别接受不同强度照射。4 d后检测各组细胞凋亡、活力及细胞内游离Ca~(2+)浓度,酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量,RT-PCR及Western-blot检测各个实验组hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达。结果:与正常组比较,LPS组hPDLFs细胞凋亡率及细胞内游离Ca~(2+)浓度增加,细胞活力降低(P0.05),细胞的上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著升高(P0.05),Ca~(2+)hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达显著升高(P0.05)。与LPS组比较,LPS+LLLI组细胞凋亡率及细胞内游离Ca~(2+)浓度降低,细胞活力升高(P0.05)。细胞的上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著降低(P 0.05),Ca~(2+)hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达显著降低(P0.05)。结论:LLLI对LPS诱导hPDLFs炎性损伤有保护作用,照射强度为4 J/cm~2时效果最明显。     

蜂毒肽MP-1体外拮抗内毒素作用及其机制

目的 观察蜂毒肽MP-1的体外抗内毒素(LPS)活性并探讨其作用机制. 方法 应用生物传感器检测MP-1对类脂A(lipid A)的亲合力,采用动态比浊法鲎试验检测MP-1对LPS(2μg/L)的中和作用,激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度MP-1(5,10,20,40 μmol/L)干预后异硫氰酸荧光素标记LPS(FITC-LPS,100 μg/L)与小鼠RAW264.7细胞的结合,免疫细胞化学法观察MP-1对LPS(100μg/L)诱导的RAW264.7细胞TLR4表达的影响;实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测不同浓度MP-1作用下LPS(100μg/L)刺激的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6基因及蛋白的表达;MTT法检测MP-1对RAW264.7细胞活力的影响. 结果 MP-1具有一定的结合lipid A及中和LPS的作用,在10 μmol/L浓度可显著抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞结合(P<0.05),并对LPS刺激的小鼠RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6的基因及蛋白表达有抑制作用(P<0.05或<0.01),该作用具有一定的剂量效应关系.MP-1体外实验浓度对细胞活力无影响(P>0.05). 结论 MP-1可能通过中和LPS作用,阻断LPS与RAW264.7细胞膜受体的结合,从而抑制LPS介导的细胞活化.     

基质糖基化对角质形成细胞迁移功能损害的机制

目的 探讨糖尿病条件下大鼠创面愈合过程中角质形成细胞迁移功能受损的可能机制.方法 选用SD大鼠6只,取背部表皮进行角质形成细胞培养;制作并鉴定糖基化基质模型;评价糖基化基质对正常大鼠角质形成细胞迁移功能的影响;测定糖基化基质对正常大鼠角质形成细胞粘附功能、培养12,24 h黏附形态、伪足形成、微丝表达、整合素表达的影响.结果 糖基化层黏连蛋白对细胞迁移较对照组有明显抑制(P＜0.05);对细胞贴壁率无明显影响(P＞0.05),但抑制了细胞的伸展及伪足的伸出,干扰了微丝的聚集,降低了整合素的表达(P＜0.05).结论 正常大鼠皮肤角质形成细胞在糖基化基质上出现迁移功能受阻,这可能是与整合素信号传导出现障碍,引起整合素、肌动蛋白表达减少和微丝形成,从而引起丝状伪足和板状伪足形成减少有关.     

MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

 目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-9及组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达及其临床意义。方法 采用SP免疫组化法检测62例NSCLC中MMP-9和TIMP-1蛋白的表达水平。结果 MMP-9和TIMP-1的阳性表达率分别为74.2％和69.4％。腺癌中二者表达率均显著高于鳞癌(P＜0.05)。随肿瘤TNM分期增加而二者表达率增高,Ⅲ+Ⅳ期二者阳性表达率均显著高于Ⅰ+Ⅱ期(P＜0.05)。淋巴结转移组的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P＜0.05)。结论 MMP-9可作为判断肺癌恶性程度、转移及预后的指标。TIMP-1不是简单对MMP-9的局部升高起反应。     

TOLL样受体4对脂多糖致急性肺损伤大鼠炎症因子的影响

目的 探讨TOLL样受体4（TLR-4）表达对脂多糖诱导急性肺损伤（ALI）大鼠体内炎症因子的影响,明确阻断TLR-4表达对急性肺损伤的保护作用.方法 45只雄性Wistar大鼠随机分为：正常对照组、ALI组和干预组,每组15只.ALI组和干预组采用静脉注射脂多糖（LPS）方法构建急性肺损伤模型,对照组注射等量的生理盐水.各组动物再按照观察时间点平均分为造模后6、12和24 h各3个亚组.测定各组肺组织TLR-4 mRNA表达以及支气管肺泡灌洗液中炎症因子浓度,观察各组大鼠肺组织的病理变化.结果 LPS可以导致肺泡腔内TNF-α、IL-1β和IL-6浓度增加,阻断TLR-4受体会抑制炎症因子释放;ALI组的肺损伤评分高于干预组和正常对照组（3.3±1.1 vs.1.9±1.0 vs.1.2±0.9）.结论 阻断TLR-4表达能抑制脂多糖诱导ALI大鼠体内炎症因子分泌,减轻肺组织病理损害,能达到治疗ALI的作用.     

Toll样受体4与肿瘤及其放射敏感性的研究进展

Toll样受体4（TLR4）是一类重要的模式识别受体,不但广泛表达于免疫细胞,也表达于各种肿瘤细胞。TLR4通过不同的信号转导机制促进肿瘤的发生、发展、免疫逃逸、凋亡抵抗、转移和侵袭。激活的TLR4在肿瘤微环境中起着重要作用,且高表达的TLR4影响着肿瘤细胞的放射敏感性,进而严重影响肿瘤放疗的效果,对这些机制的研究可以进一步明确放疗的作用靶点,为恶性肿瘤的治疗提供新的手段。     

阿托伐他汀对心脏成纤维细胞MMP-9/TIMP-1表达的影响

目的：观察阿托伐他汀（atorvastatin）对心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶-9/组织型基质金属蛋白酶抑制因子-1（MMP-9/TIMP-1）表达的影响。方法：体外培养乳鼠心脏成纤维细胞（CF）,做细胞形态观察和心脏成纤维细胞标志性波形蛋白免疫荧光组化检测,明胶酶谱法测定MMP-9的活性,RT-PCR检测MMP-9和TIMP-1mRNA的表达。结果：AngⅡ增加MMP-9的活性及mRNA的表达（P〈0.05）,同时TIMP-1的mRNA表达减少（P〈0.05）,阿托伐他汀在某种程度上可逆转上述变化（P〈0.05）。结论：Aorvastatin通过对MMP-9/TIMP-1表达的影响作为预防和治疗房颤的重要机制之一。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

Expression levels of matrix metalloproteinase (MMP)-9 and its specific inhibitor TIMP-1, in septic and aseptic arthritis of the knee

Purpose

In cases of septic knee arthritis, there is excess of matrix metalloproteinases (MMPs) over tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), due to enhanced expression and activation that are induced by bacteria in comparison with rheumatic or degenerative arthritis. The aim of this study was to explore the expression levels of synovial gelatinase MMP-9 and its specific inhibitor TIMP-1 in septic and aseptic arthritis and their potential use as additional aids to clinical investigation.

Methods

Gelatin zymography and western blot analysis were applied in effusions from knees of the patients with septic (SA—10 patients), rheumatic (RA—10 patients) and osteoarthritis (OA—10 patients).

Results

Zymographic analysis revealed that all samples contained latent MMP-2 activity, albeit activated MMP-2 appeared in more of the septic than aseptic effusions. MMP-9 was not detected in osteoarthritic synovial fluid samples. Only trace amounts of MMP-9 activity were detected in 4 of 10 patients with RA, whereas higher MMP-9 levels were evident in all samples from SA (P = 0.0241). In immunoblotting assays, samples from SA showed significantly higher levels of MMP-9 compared with samples from RA (P = 0.0052), confirming zymographic results. Although no significant difference in TIMP-1 levels was observed, the estimated MMP-9/TIMP-1 ratio of septic effusions was significantly higher compared with aseptic ones (P = 0.0029).

Conclusions

The data presented suggest enhanced expression and activation of MMP-9 in septic native knee arthritis compared with aseptic. The presence of high levels of MMP-9 with concomitantly increased MMP-9/TIMP-1 ratio and activated gelatinases in effusions, independent of neutrophilic counts, may be indicative for infection.     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

目的 探讨类固醇受体辅活化子（SRC）-3蛋白在脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中的作用.方法 健康SPF级雌性野生型（SRC-3＋/＋）小鼠、SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠各5只,分别分离和原代培养腹腔巨噬细胞,并相应分为SRC-3＋/＋组和SRC-3-/-组.收集并调整细胞浓度为1×106/ml,接种于6孔板,1 ml/孔,给予10 μg/ml LPS刺激,分别在刺激前（0 h）、刺激后4 h和12 h收集腹腔巨噬细胞.通过Western blot测定腹腔巨噬细胞Toll样受体4（TLR4）的表达,并通过transwell趋化实验和中性红吞噬实验,分别测定腹腔巨噬细胞的趋化指数（CI）和吞噬功能.结果 LPS诱导前两组腹腔巨噬细胞TLR4的蛋白表达和CI差别无统计学意义,但SRC-3-/-组的吞噬功能显著低于SRC-3＋/＋组（P＜0.01）;无论是SRC-3＋/＋组,还是SRC-3-/-组,LPS诱导4 h和12 h后,两组腹腔巨噬细胞TLR4的表达和CI均显著增高（P＜0.01）,但在相应时间点,SRC-3-/-组与SRC-3＋/＋组相比差别无统计学意义.LPS刺激4 h后,两组吞噬功能均显著增加（P＜0.01）,但SRC-3-/-组增加的程度显著低于SRC-3＋/＋组（P＜0.01）;相反,LPS刺激12 h后,两组吞噬功能均受到不同程度的抑制（P＜0.05或P＜0.01）,且SRC-3-/-组较SRC-3＋/＋组抑制的程度更低（P＜0.01）.结论 SRC-3调节腹腔巨噬细胞的先天性免疫功能可能与吞噬功能有关,而与其趋化功能无关.