转录共激活子p300及表观修饰在高糖致人系膜细胞代谢记忆中的汇聚作用

目的 以人系膜细胞(HMCs)作为体外模拟代谢记忆的研究对象,观察转录共激活子p300及组蛋白乙酰化蛋白H3(Ac-H3)、Ac-H4的表达规律,并探讨p300在其中的潜在汇集点作用.方法 将培养的HMCs按以下分组处理:①高糖诱导代谢记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)、渗透压组(LG,NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d),高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d)、记忆组(M1、M2、M3组,25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)、持续正糖组(NC,5.5mmol/L D-葡萄糖×9d).②糖其化终产物记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);正糖+AGEs组(AGEs,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d);AGEs记忆组(AGEs-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);BSA组(NG+BSA,给予同浓度BSA对照).③H2O2模拟氧化应激记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×30min);正糖+H2O2组(H2O2,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min); H2O2记忆组(H2O2-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);正糖对照组(NG3,5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).④蛋白激酶C(PKC)β2激活记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d);记忆组(M,25mmol/L D-葡萄糖×2d +5.5mmol/LD-葡萄糖×3d);空载体记忆组(HN,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d); PKCβ2激活记忆组(PO,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);PKCβ2抑制剂记忆组(PI,25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).采用二氢二氯荧光素(DCFDA)及酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的表达.Western blotting检测各组细胞p300、Ac-H3和Ac-H4及PKCβ2蛋白的表达水平.结果 HG组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达增加,分别较NG组增加了1.15倍、0.93倍和0.87倍(P＜0.05),同时伴有PKCβ2蛋白及胞内ROS水平上调;M1、M2、M3组p300、Ac-H3、Ac-H4、PKCβ2蛋白水平及ROS表达水平与NG组比较仍显著升高,即使M3组亦较NG组分别增加75％、49％、47％、98％和48％(P＜0.05).AGEs组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调,较对照组分别升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P＜0.05),AGE-M组各蛋白较对照组分别增加了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P＜0.05).H2O2组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达均升高,较对照组分别升高了1.03倍、0.85倍和0.79倍(P＜0.05),而H2O2-M组各蛋白表达较对照组的差异无统计学意义.与M组比较,PO组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达进一步上调,分别为M组的1.25倍、1.06倍和1.10倍(P＜0.05),选择性PKCβ2抑制剂CGP53353可以显著降低上述蛋白表达.结论 HMCs存在转录共激活子p300及表观修饰持续活化的记忆效应,p300可能系高糖致生化代谢及表观遗传记忆刺激的汇聚点.     

血清脂肪酸结合蛋白4与3岁及以下儿童自闭症谱系障碍诊断及神经发育的相关性

目的 探讨血清脂肪酸结合蛋白4(FABP4)水平与3岁以下儿童自闭症谱系障碍(ASD)诊断及神经发育的相关性。方法 选取2019-05至2022-04空军军医大学第一附属医院儿科和儿童心理科共招募60例≤3岁ASD儿童为研究对象(ASD组),另外纳入同时期正常发育儿童共68例作为对照组。使用酶联免疫吸附试验法测定血清FABP4浓度。ASD的症状用Kaufman儿童成套评价测验(K-ABC)、自闭症诊断观察量表第2版(ADOS-2)进行评估。采用中国儿童神经心理行为检查量表2016版(CNBS-R2016)评估ASD患儿的神经发育水平，计算发育商(DQ),DQ<70分定义为发育障碍。结果 ASD组血清FABP4[14.83(9.83,17.93)ng/ml]、血清游离脂肪酸[354.88(282.86,407.76)μmol/L]、血清脂联素[17.04(15.12,21.39)μg/ml]水平显著低于对照组的血清FABP4[17.89(14.05,21.85)ng/ml]、血清游离脂肪酸[410.75(377.51,460.90)μmol/L]、血清脂联素[19.45(18.23...     

高压氧对2型糖尿病大鼠降糖作用的机制研究

目的 观察高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)对2型糖尿病GK大鼠的降糖作用并探讨其作用机制.方法 选取5个月龄SPF级雄性GK大鼠72只(空腹血糖均在16.7 mmol/L以上),采用数字表法随机分为3组,即模型组、二甲双胍组、HBO组,每组再分成3个亚组,每组均为8只.另取24只Wistar大鼠为正常对照组,每次取8只用于3个不同的实验.HBO组每天行HBO治疗:0.15 MPa纯氧,稳压吸氧30 min;二甲双胍组按250 mg/(kg·d)用二甲双胍混悬液灌胃;正常对照组、模型组、HBO组每天按5 ml/(kg·d)灌服纯净水.1～3周后测定空腹血糖、葡萄糖转运蛋白含量.取1只Wistar大鼠、2只HBO组大鼠进行72 h血糖动态监测.所有大鼠隔日测定禁食4h后血糖,每组取2只大鼠电镜下观察胰腺组织中胰岛B细胞超微结构.结果 GK大鼠二甲双胍组第7天血糖为(9.71 ±2.07)mmol/L,HBO组第7天血糖为(9.79±2.12 )mmol/L,模型组血糖为(9.99±2.31) mmol/L,对照组血糖为(4.90±0.56) mmol/L,各组空腹血糖值比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗第7天时,对照组血清葡萄糖转运蛋白浓度为(7.12 ±2.11) ng/L,模型组为(3.98±1.25) ng/L,二甲双胍组为(4.56±1.76) ng/L,HBO组为(4.37 ±0.68) ng/L,各组比较差异有统计学意义(P＜0.01);治疗第14天时,对照组血清葡萄糖转运蛋白浓度为(7.06 ±0.54) ng/L,模型组为(3.99 ±0.85) ng/L,二甲双胍组为(5.06±0.77)ng/L,对照组与模型组、二甲双胍组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HBO可能通过提高葡萄糖转运蛋白水平、改善胰岛B细胞结构与功能而起到降低血糖的作用.     

补充银杏制剂对过度训练大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的 :观察银杏制剂对过度训练大鼠心肌细胞凋亡的影响 ,探讨通过干预细胞凋亡而实现对运动心脏的保护作用。方法 :2 4只雄性SD大鼠随机分为 3组 :A组 :安静对照组 (n =8) ;B组 :过度训练组 (n =8) ,递增负荷游泳训练 7周 ;C组 :过度训练 +喂服银杏组 (n =8) ,训练方案同B组 ,同时喂服银杏片 5 0mg/kg/d ,3组大鼠于 7周后取材。采用原位末端标记 (TUNEL)、流式细胞术和免疫组化法分别检测大鼠心肌细胞凋亡及Bcl - 2、Bax基因表达 ,同时检测大鼠血浆和心肌细胞超氧化物歧化酶 (SOD)活性及丙二醛 (MDA)含量。结果 :(1)过度训练对心肌细胞凋亡率的影响 :B组大鼠心肌细胞凋亡率显著高于A组 (P <0 0 5 ) ,C组大鼠心肌细胞凋亡率显著低于B组 (P <0 0 1) ,与A组比较无显著差异。 (2 )与A组相比 ,B组大鼠心肌细胞Bcl- 2蛋白表达显著减弱 ,Bax蛋白表达显著增强 (P <0 0 5 ) ,而C组这两种蛋白的表达与A组均无显著差异。 (3)与A组相比 ,B组大鼠血浆和心肌细胞抗氧化酶SOD活性显著降低 ,脂质过氧化产物MDA显著增加。而C组与A组无显著差异。结论 :银杏制剂可通过其抗氧化作用及影响凋亡相关基因的表达而抑制心肌细胞过度凋亡 ,从而发挥心肌保护作用。     

脂肪间充质干细胞促进肝脏糖酵解对2型糖尿病大鼠高血糖的改善作用研究

目的 观察脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)输注对2型糖尿病大鼠的短期降糖效应,并初步探讨其通过肝脏糖代谢途径调控血糖的作用机制.方法 SD大鼠高脂喂养8周后腹腔单次注射小剂量链脲佐菌素(STZ,25mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型,输注脂肪间充质干细胞后于指定时间点(0、3、6、12、24h)尾静脉取血测定血糖,同时于相应时间点处死大鼠留取肝脏组织标本,利用Real-time qPCR和Western blotting分别检测各组大鼠肝脏组织中糖酵解过程关键限速酶[葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)]的mRNA和蛋白表达情况.结果 将成功提取的脂肪间充质于细胞经尾静脉输注到2型糖尿病大鼠体内(2×106个/只),大鼠血糖水平在短时间内明显降低,分别为30.55±1.49mmol/L(0h)、18.90±0.85mmol/L(3h)、23.70±1.13mmol/L(6h)、21.90±1.00mmol/L(12h).PCR结果显示细胞输注后3h糖尿病大鼠肝脏组织中GK、PFK均有上调的趋势,在6h时PK明显上调(P＜0.05).Western blotting结果显示,细胞输注后PK和GK蛋白水平在不同时间点均明显上调(P＜0.05).结论 脂肪间充质干细胞可以在短时间内有效改善2型糖尿病大鼠的高血糖状态,其机制可能是通过促进肝脏糖酵解而调节血糖水平.     

BCAA代谢障碍在儿茶酚胺诱导心肌细胞毒性中作用

目的探讨心肌细胞支链氨基酸(BCAA)代谢障碍在儿茶酚胺诱导的心肌细胞毒性中的作用。方法分离并培养新生大鼠心室肌细胞(NRVMs),给予异丙肾上腺素(ISO)20μmol/L处理48 h模拟儿茶酚胺毒性,ISO刺激同时给予支链α-酮酸脱氢酶激酶(BDK)特异性抑制剂3,6-二氯-2-苯并噻吩羧酸(BT2)处理(40μmol/L)。48 h后,蛋白质印迹法(Western blot)检测BCAA代谢相关酶及细胞凋亡相关酶蛋白的表达;分光光度法检测支链-α酮酸脱氢酶(BCKD)活性;给予外源性BCAA(5 mmol/L)后,分时间点检测培养基中BCAA浓度,直接反映心肌细胞BCAA降解速率;流式细胞术检测心肌细胞凋亡。结果 ISO处理激活心肌细胞线粒体凋亡通路并引起心肌细胞凋亡。与对照组比较,ISO组心肌细胞中BDK表达明显上调,引起BCKD活性下降和BCAA降解障碍。给予BDK抑制剂BT2处理后,能够逆转ISO刺激造成的心肌细胞BCAA降解障碍并明显抑制心肌细胞凋亡。结论抑制BDK能够减轻儿茶酚胺毒性诱导的心肌细胞凋亡,改善心肌BCAA降解障碍有可能成为减轻儿茶酚胺毒性的新策略。     

游离脂肪酸可抑制大鼠骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用

目的：观察游离脂肪酸对大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）基因及蛋白表达的影响。方法：分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠骨骼肌细胞,分别与软脂酸（0．25mmol/L)或油酸（0．125mmol/L)孵育12、24、36h,提取蛋白后用Western印迹法检测葡萄糖转运蛋白4（GTUT4）的蛋白水平;用斑点和印迹杂交法检测骨骼肌细胞内GLUT4 RNA含量的变化。结果：经软脂酸和油酸孵育12、24、36h后骨骼肌细胞GLUT4的蛋白和RNA水平均显著降低（P＜0．05）。结论：游离脂肪酸可抑制葡萄糖转运蛋白4的基因及蛋白表达。     

rhBNP对心肌梗死后心肌细胞病理学和细胞凋亡的研究

目的:观察rhBNP对大鼠心肌梗死后心肌细胞病理学和细胞凋亡的影响。方法:建立大鼠心肌梗死模型,分为MI对照组和BNP治疗组。治疗组给予rhBNP连续静滴4周,治疗48 h、1、2、3和4周时处死大鼠,进行心肌组织切片HE染色,TUNEL法测心肌细胞凋亡指数MAI,免疫组化测Fas与FasL蛋白阳性染色指数。结果:治疗组MAI和Fas/Fasl蛋白阳性率与对照组比较下降有显著性差异(P<0.05)。结论:连续给予rhBNP能够通过减少MI后心肌细胞凋亡保护缺血心肌,达到改善心功能的目的。     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

强化胰岛素对严重烧伤大鼠心肌细胞TNF-α表达的抑制作用

目的探讨强化胰岛素对严重烧伤大鼠心肌细胞TNF-α表达的抑制作用及其可能机制。方法健康雄性SD大鼠18只,右颈静脉及左心室插管,随机均分为3组:假伤组,大鼠给以假烫;烧伤组,制作30%TBSAⅢ度烫伤后,常规给以液体复苏;强化组,烫伤后给以强化胰岛素治疗,液体总量同烫伤组。测定伤后0、1、2、3、4、5、6h的血糖及左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LV-EDP)。伤后6h处死动物,留取左心室组织,分别用ELISA和定量PCR法测定TNF-α蛋白及其mRNA水平,Westernblot观察p-IκBα和IκBα变化。同时用烧伤血清培养新生鼠心肌细胞,观察胰岛素及其活化抑制剂LY294002对p-IκBα水平的影响。结果与假伤组比较,烧伤组动物伤后出现应激性高血糖反应,LVSP降低,LVEDP升高,左心室组织TNF-α蛋白及mRNA水平升高,p-IκBα蛋白表达增高,IκBα蛋白表达降低(P<0.05或0.01)。烧伤大鼠经强化胰岛素治疗后,血糖维持在4.5～5.2mmol/L之间,左心室功能得到明显改善,左心室组织TNF-α蛋白及mRNA水平显著降低,κBα的磷酸化和降解明显减轻(P<0.05或0.01)。LY294002能够消除胰岛素对烧伤血清培养心肌细胞κBα磷酸化的抑制作用。结论强化胰岛素可能通过减少IκBα的磷酸化降解而降低NF-κB活化,进而抑制心肌细胞TNF-α的转录与表达,发挥改善心肌功能的作用。