费氏链霉菌遗传操作体系的优化与应用

目的 建立并优化费氏链霉菌的遗传操作体系,并通过分子改造得到新霉素效价提高的重组菌株,为后续获得新霉素高产菌株奠定理论基础。方法 选择费氏链霉菌最适产孢培养基和抗性筛选标记,对接合转移体系的关键影响因素进行优化,获得过表达neoC基因的重组菌株,以进一步研究neoC基因对新霉素效价的影响。结果 费氏链霉菌接合转移最适培养基为A75培养基,孢子最适处理条件为50℃热激10min,37℃预培养4h,最适供受比为10:1,安普霉素最适添加时间为15h,优化后接合转移频率提高了7.69倍,并得到了一株新霉素效价提高了22.29%的neoC基因过表达菌株SF-neoC。结论 成功建立并优化了费氏链霉菌的遗传操作体系,为后续基于费氏链霉菌分子改造的其它应用提供依据。     

双拷贝tylD、tylF和tylJ弗氏链霉菌工程菌株构建及其发酵性能研究

以弗氏链霉菌工业生产菌株基因组DNA为模板，扩增泰乐星生物合成及组分转化关键基因tylD、tylF和tylJ，构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株。通过摇瓶发酵验证了工程菌株泰乐菌素发酵效价，并对筛选的一株工程菌利用荧光定量PCR检测其tylD、tylF和tylJ基因表达情况。研究结果表明，双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株泰乐菌素摇瓶发酵效价较出发菌株最高提高了28.1%，该菌株tylD、tylF、tylJ表达水平高于出发菌株，并且在进入稳定期后期表达量达到最大值。构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株可解除泰乐菌素合成限速环节，大幅度的提高泰乐菌素产量。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。     

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。     

泰乐菌素基因工程菌的构建

目的构建具有双拷贝tylF基因的泰乐菌素基因工程菌,以解决泰乐菌素基因生物合成的限速环节,提高泰乐菌素的发酵产量。方法通过SOE-PCR获得PermE-tylF基因,构建随机整合型重组质粒pBH05,通过接合转移将PermE-tylF基因及其载体随机整合到弗氏链霉菌的基因组中,并通过抗性筛选获得重组菌株D-120。将重组菌株D-120进行摇瓶发酵,采用生物效价测定的二剂量法测定泰乐菌素的发酵单位。结果在相同的发酵条件下,重组菌株泰乐菌素的发酵单位较出发菌株提高32.7%。结论该基因工程菌的构建改善了泰乐菌素生物合成的限速环节,大幅度提高了泰乐菌素的发酵效价。     

重离子束辐照诱变及高通量筛选金霉素高产菌株

应用不同剂量12C+6重离子束对金霉素链霉菌出发菌株B9-34-125进行辐照诱变,并应用96和48孔板高通量筛选金霉素高产菌株。结果表明：当重离子束12C+6离子的辐照剂量为60Gy时,对金霉素链霉菌的诱变效果显著,筛选出5株优势菌株,其中Z-1452菌株摇瓶发酵效价较对照提高14.4%,60m3发酵效价较对照提高5.7%,产量提高了2.6%。     

格尔德霉素发酵工艺的优化

目的研究格尔德霉素产生菌吸水链霉菌SIPI.A.2039的发酵工艺,以提高产生菌生物合成格尔德霉素的能力。方法以本实验室保藏的吸水链霉菌SIPI.A.2039为出发菌株,从摇床转速、摇瓶装量、碳源、50L发酵罐参数等方面进行发酵工艺的优化研究。结果采用经过优化获得的发酵培养基和培养条件,发酵周期为144h时,格尔德霉素的摇瓶发酵效价可由原来的230μg/mL提高至2500μg/mL。在50L发酵罐中采用优化的溶解氧和补料工艺能够使格尔德霉素的发酵效价达到3700μg/mL,并使发酵周期比摇瓶缩短了48h。结论本实验得到的结果比国内外报道的格尔德霉素的发酵效价提高了两倍以上,该发酵工艺已经达到了产业化的要求。     

紫外线诱变育种提高土霉素菌种的生产能力

以土霉素产生菌龟裂链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｉｍｏｓｕｓ）Ｌｆ－２为出发菌株，经紫外线处理后，再经摇瓶初筛、复筛获得高效价菌株Ｕｆ－３。又经Ｌ９（３４）的正交设计实验，确定了Ｕｆ－３的最佳培养基配比，使其摇瓶效价提高１５．２％。在２０ｍ３罐上放大试验，与出发菌株相比发酵效价提高１７．４％，发酵指数提高２３．９％     

氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究

目的筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价。方法以黑暗链霉菌Ts-228为出发菌株，经自然分离，UV诱变结合耐自身代谢产物处理，采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了Tt-49新菌株。以摇瓶发酵考察生长特性，罐上发酵绘制代谢曲线。结果效价提高了1．8倍，妥布霉素含量高达68．5％。该菌株生长周期仅4d，传代稳定。种龄18h左右，接种量10％。按照代谢曲线图进行调控，发酵罐的产抗水平达5865u／ml。结论自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。出发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显著提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。     

60Coγ射线对南昌霉素产生菌的诱变选育

采用不同剂量的^60Coγ射线，对南昌霉素产生菌南昌链霉菌80-5.3-116菌株的孢子进行处理。结果表明，7.74c/kg的诱变剂量在对孢子致死率为90％左右时，具有较好的诱变效应；初筛摇瓶产量正变率达到21.08％；复筛摇瓶发酵效价比出发菌株提高50％以上的有10株，占初筛菌株的5％；连续四批摇瓶发酵试验平均产量比出发菌株的产量提高50％以上；有6个菌株摇瓶产量分别比出发菌株提高60％，其中3株平均摇瓶产量比出发菌提高70%以上。     

青霉素高产菌株的理性筛选

以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出XY-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8．8％，且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。XY-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3．83％、5．66%和2．69％。     

海洋小单孢菌株产抗肿瘤新化合物FW05-0328-1的诱变#br# 选育及发酵工艺研究

目的 获得抗肿瘤化合物FW05-0328-1高产菌株,提高其发酵产量。方法 采用紫外(UV)及常压室温等离子体技术(ARTP)复合诱变筛选化合物FW05-0328-1高产菌株,结合高产菌株摇瓶发酵特性,优化100L全自动发酵罐发酵工艺。结果 获得1株高产FW05-0328-1菌株Micromonospora sp. FIM0O123,其在100L全自动发酵罐发酵效价达187.3mg/L,较原始菌株提高了17倍。结论 高产菌株的筛选及100L全自动发酵罐发酵工艺优化能有效提高化合物FW05-0328-1产生能力。     

海洋小单孢菌株产抗肿瘤新化合物FW05-0328-1的诱变#br# 选育及发酵工艺研究

目的 获得抗肿瘤化合物FW05-0328-1高产菌株，提高其发酵产量。方法 采用紫外(UV)及常压室温等离子体技术(ARTP)复合诱变筛选化合物FW05-0328-1高产菌株，结合高产菌株摇瓶发酵特性，优化100L全自动发酵罐发酵工艺。结果 获得1株高产FW05-0328-1菌株Micromonospora sp. FIM0O123，其在100L全自动发酵罐发酵效价达187.3mg/L，较原始菌株提高了17倍。结论 高产菌株的筛选及100L全自动发酵罐发酵工艺优化能有效提高化合物FW05-0328-1产生能力。     

12C离子束辐射选育庆大霉素高产菌株及其罐发酵水平

采用^12C离子束对庆大霉素产生菌23-18^#进行诱变，通过大量摇瓶筛选，选出5株进行2T罐中试，通过中试，选出2株高产变株在50T罐放大试验中发酵水平较出发菌株有重大突破，发酵水平及批总亿均提高10％以上。     

新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素I高产菌株#br#

目的 通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法 使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system, MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果 在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/mL左右。结论 新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。     

子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

摘要：基于子囊霉素的生物合成途径和机制，根据生物合成基因簇序列设计引物，应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因，整 合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中，成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌，命名为 AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究，结果表明，与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工 艺，AS-07工程菌与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了85%。     

供氧对红霉素基因工程菌ZL1004发酵液组分的影响

本文研究了供氧条件对红霉素基因工程菌ZL1004发酵液组分的影响。摇瓶条件下考察了不同形式的摇床和摇瓶装液量对发酵液组分的影响,发现供氧能力好的双层敞开旋转摇床有利于组分改善,发酵终点时发酵液中有效组分A为93．93％,副产物B为4．59％,C为1．48％;500ml摇瓶装液量最少时（35ml）发酵液组分最好（A组分为92．13％,B组分为1．73％,C组分为6．14％）。进一步在50L发酵罐中的研究表明,高溶氧（全程溶氧高于40％）时B组分含量一直为0％,与低溶氧（全程溶氧低于40％）相比,发酵液中A组分提高13．51％,C组分降低71．3％。研究结果说明对于红霉素基因工程菌ZL1004,发酵过程较好的供氧条件是提高发酵液有效组分的重要条件。     

他克莫司产生菌的选育和生产工艺研究

产他克莫司的原始菌株Streptomyces hzsw-1-25经紫外、60Co、HNO2等方法诱变,筛选得高产突变菌株hzsw-8-1123,优化发酵培养基后,进行摇瓶和2m3罐的发酵试验,并研究了产物的分离提取工艺.     

常压室温等离子体诱变选育替考拉宁高产菌株

目的为选育替考拉宁的高产菌株。方法采用常压室温等离子体(ARTP)技术对替考拉宁产生菌Actinoplanes teichomyceticus FIM-68的孢子进行诱变,诱变处理的孢子悬液涂布在含替考拉宁致死浓度的培养基平板上培养,获得替考拉宁抗性突变株,通过摇瓶发酵对替考拉宁抗性基因突变株进行筛选。结果获得一株遗传性状稳定的替考拉宁高产菌Actinoplanes teichomyceticus FIM-68-66菌株,其产替考拉宁能力提高了2倍。结论这是首次报道采用常压室温等离子体诱变技术有效提高替考游动放线菌产替考拉宁能力,所获得的替考拉宁高产菌株可望用于替考拉宁的工业化生产。