人体β-防御素-3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达

目的从人正常皮肤组织中提取β-防御索-3基因进行定点突变后在E．coli中融合表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到编码β-防御素-3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E．coli中融合表达。结果测序结果表明，经RT—PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β-防御索-3成熟肽的cDNA序列完全-致。经过突变β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E．coli中诱导表达3～5h后可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论成功构建并表达了β-防御素-3突变体基因，为进-步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。     

糖原合成酶激酶3β转基因细胞模型的建立

目的建立GSK3β(糖原合成酶激酶3β)转基因细胞模型。方法RT-PCR方法扩增GSK3β基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染PC12细胞;Western blot验证稳定株;染色质染色法和流式细胞术检测细胞凋亡;MTT法确定细胞接种条件。结果成功获得GSK3β融合载体;并建立GSK3β转基因细胞株;转基因组中GSK3β蛋白表达量明显高于对照组,染色质明显浓染甚至出现凋亡小体,去血清后该变化更加明显;GSK3β转基因组早期凋亡的细胞含量比对照组明显增多;确立了转基因细胞筛选化合物的接种条件。结论成功建立GSK3β转基因细胞模型。     

11_β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂的临床应用

近年来,有研究发现11β-羟基类固醇脱氢酶可能参与了以2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、高血压等为主要表现的代谢综合征的病理生理过程,选择性的11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂很有可能成为治疗糖尿病、肥胖症等疾病的新药。本文就11β-HSD的作用1、1β-HSD抑制剂种类与作用等作一综述。     

七氟醚通过海马PICK1/ERK1/2/GSK3β信号抑制记忆巩固的研究

目的 研究七氟醚对记忆巩固的影响,并探讨PICK1/ERK1/2/GSK3β信号通路在其中的作用。方法 采用C57BL/6J PICK1基因敲除小鼠进行七氟醚处理（2%,3 h）,提取动物海马组织蛋白,采用Western blot检测PICK1、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β及p-GSK3β蛋白表达变化。采用原代海马神经细胞,加入ERK1/2磷酸化激动剂Honokiol和/或PICK1抑制剂FSC231,再进行七氟醚处理（2%,3 h）,检测p-GSK3b蛋白表达变化。通过旷场试验检测动物运动能力变化,抑制性逃避试验检测动物记忆巩固的变化。结果 在体实验中,单独进行七氟醚处理或敲除PICK1基因均可明显降低PICK1、p-ERK1/2及p-GSK3β的蛋白表达水平。与七氟醚组相比,PICK1基因敲除+七氟醚处理组,p-ERK1/2及p-GSK3β的蛋白表达水平进一步降低。离体实验中,七氟醚可降低p-GSK3β蛋白表达水平,加入Honokiol可使p-GSK3β蛋白表达增加,而再加入FSC231则可逆转由Honokiol引起的p-GSK3β蛋白变化。行为学结果显示,七氟醚处理或PICK1基因敲除动物运动能力无明显变化,而七氟醚可抑制记忆巩固;PICK1基因敲除小鼠进行七氟醚处理,则可加重抑制记忆巩固。结论 七氟醚可抑制记忆巩固过程,其机制可能与PICK1/ERK1/2/GSK3β信号通路受抑制相关。     

Δ5-3β,7β-二羟基甾醇和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇的立体选择合成及其对胆碱酯酶的抑制活性

目的研究不同支链结构的Δ5-3β,7β-二羟基甾醇和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇对胆碱酯酶的抑制活性.方法以3个不同支链结构的Δ5-3β-羟基甾醇为起始物,先乙酰化保护3β-羟基,再烯丙位氧化引入7-羰基,该羰基分别用NaBH4-CeCl3和L-selectride还原成不同取向的羟基,最后水解除去保护基得到6个不同支链结构的Δ5-3β,7β-二羟基甾醇和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇,进而对目标化合物进行乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性实验.结果合成的6个化合物对乙酰胆碱酯酶无明显的抑制活性(IC50>100 μmol·L-1),对丁酰胆碱酯酶则有较强的抑制活性(IC50< 32 μmol·L-1),其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇的抑制活性最强(IC50=9.5 μmol·L-1).结论 7位羟基的取向和不同的支链结构对化合物1～6发挥丁酰胆碱酯酶体外抑制活性有一定的影响.     

β3—肾上腺素受体激动剂的研究进展

β3－肾上腺素受体（β3AR)主要存在于具有产热功能的棕色和白色脂肪细胞上,β3AR激动剂可调节人体内热量平衡、葡萄糖代谢、能量消耗,纠正产热不足,临床用于治疗糖尿病和肥胖症。文中对β3AR激动剂的结构类型及部分处于临床研究阶段的药物进行了综述。     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

miR-214表达载体构建及其对靶基因β-catenin的调控

目的:构建miR-214真核表达载体,验证miR-214对其靶基因β-catenin的调控作用。方法:以基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增包括miR-214前体的基因序列,将其插入表达载体pcDNA3.1(+)获得pcDNA3.1-miR-214真核表达载体。将其转染到A549细胞后,通过实时定量PCR(Real-time PCR)方法对其表达情况进行验证。应用生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对miR-214靶基因进行预测,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-214对靶基因β-catenin的3’UTR区的调控作用。通过Westernblot方法检测miR-214对β-catenin蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-214表达载体pCDNA3.1-miR-214。Real-timePCR结果表明pCDNA3.1-miR-214在A549细胞中能够过表达成熟的miR-214基因。生物信息学预测β-catenin是miR-214的靶基因,并构建融合β-catenin的3’UTR区表达质粒pMIR-β-catenin,在此基础上对β-catenin的3’UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明miR-214能够作用于β-catenin的3’UTR。Westernblot方法进一步证实β-catenin是miR-214的靶基因。结论:miR-214作用于β-catenin的3’UTR,可在转录后水平调控β-catenin的表达。     

TGF-β1-Samd3信号转导在星形胶质细胞增殖中的作用

目的探讨TGF-β1对体外培养的星形胶质细胞增殖的影响及其Smad3信号转导机制。方法体外培养的原代星形胶质细胞,传代接种后采用SiRNA基因沉默技术,干扰Smad3基因的表达,RT-PCR验证沉默效果,应用免疫荧光技术观察干扰TGF-β1-Smad3通路后对星形胶质细胞增殖的影响。结果 TGF-β1对星形胶质细胞增殖有明显促进作用,并呈现一定的剂量依赖性;成功沉默Smad3基因后,星形胶质细胞的增殖率明显减低;成功沉默Smad3基因能干扰TGF-β1对星形胶质细胞增殖的促进作用。结论 TGF-β1-Smad3信号转导通路对星形胶质细胞增殖起调节作用。     

人类β3肾上腺素受体基因多态性与疾病相关性研究进展

人类β3肾上腺素受体在机体的能量动员和利用的调节中发挥着举足轻重的作用。β3受体基因的第64个密码子发生错义突变,导致色氨酸被精氨酸置换。这个突变在细胞系和分离的人体脂肪组织细胞中均对受体功能产生影响。同时它与2型糖尿病发病提早、胰岛素抵抗的某些特征和肥胖有密切的联系。最近研究发现,Trp64Arg突变与许多其他候选基因的突变有累加和协同作用。本文主要对人类β3肾上腺素受体多态性的功能意义及其与疾病的相关性作一综述。     

β3肾上腺素能受体与心力衰竭的研究进展

早期关于β3肾上腺素能受体（β3－adrenergicreceptors,β3－AR）的研究主要限于代谢性疾病,近来发现心脏β3－AR激动表现为负性肌力作用,这与心力衰竭（heartfailure,HF）的发生发展密切相关。本文就β3－AR与HF的研究进展作以综述。     

11β-羟化类固醇脱氢酶1促进3T3-L1前脂肪细胞分化机制

目的 探讨11β-羟化类固醇脱氢酶1（11β-HSDl）促3T3-L1前脂肪细胞分化机制及其在肥胖中的作用。方法 采用油红染色观察脂滴堆积情况；采用Western blot方法检测11β-HSD1的表达。应用氢化可的松刺激模型，采用实时定量PCR观察11β-HSD1和糖皮质激素受体（GR）表达的变化。应用实时定量PCR检测脂肪细胞分化标志基因的变化。结果 （1）油红染色显示脂滴堆积随着小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）细胞分化过程逐渐增加。（2）在3T3-L1前脂肪细胞分化模型中（0、2、4、6、8d），11β-HSD1蛋白水平是上调的，证实1113-HSDl蛋白分子量为34000。（3）11β-HSD1及GR的mRNA表达在分化过程中是上调的。（4）11β-HSD1对氢化可的松的刺激是时间和浓度依赖的，而氢化可的松的刺激对GR影响不大。（5）脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸合成酶（FAS）、脂肪酸结合蛋白（aP2）在分化过程中明显上升，前脂肪细胞因子-1（Pref-1）在分化早期升高，在分化后期明显下调。结论 11β-HSDl通过受体前调节作用促进前脂肪细胞分化，参与肥胖的发生。     

人绒毛及胎盘组织中β-防御素-3基因表达

目的 检测人β-防御素-3基因在妊娠绒毛及胎盘组织中的表达．方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测正常妊娠早孕绒毛、蜕膜及晚孕胎盘、胎膜及脐带组织中HBD-3的表达,同时用甘油醛-3磷酸脱氢酶作内参照。结果 HBD-3在绒毛、胎盘及胎膜组织中均有表达,但在蜕膜、脐带组织中不表达。结论 HBD-3在妊娠组织中的表达,提示其在妊娠期内环境的稳定、天然抗感染免疫中发挥重要作用、     

GSK-3β活性调节与肿瘤治疗

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)作为细胞内主要的丝氨酸/苏氨酸家族激酶,其活性异常与多种疾病的发生发展密切相关。值得关注的是,GSK-3β对肿瘤进程的调节是双向的,当扮演"促瘤因子"角色的GSK-3β被抑制时,不可避免阻断了其"抑瘤因子"的功能,使得Wnt/β-catenin信号通路的激活,成为目前靶向肿瘤GSK-3β引起治疗矛盾的焦点。事实上,生物学的绝缘机制可以使GSK-3β在广泛参与细胞内众多信号通路的调节中互不干扰,从而决定了细胞命运。因此,深入了解GSK-3β在不同信号系统中活性调节的具体机制,或者设计底物特异的竞争性抑制剂,对于在靶向GSK-3β的肿瘤治疗中采取选择性的权衡策略具有重大意义。     

β3肾上腺素能受体与心力衰竭的研究进展

早期关于β3肾上腺素能受体(B3-adrenergic receptors,B3-AR)的研究主要限于代谢性疾病,近来发现心脏β-AR激动表现为负性肌力作用,这与心力衰竭(heart failure,HF)的发生发展密切相关.本文就β-AR与HF的研究进展作以综述.     

β3肾上腺素能受体与心力衰竭的研究进展

早期关于β3肾上腺素能受体(B3-adrenergic receptors,B3-AR)的研究主要限于代谢性疾病,近来发现心脏β-AR激动表现为负性肌力作用,这与心力衰竭(heart failure,HF)的发生发展密切相关.本文就β-AR与HF的研究进展作以综述.     

β3-肾上腺素受体激动剂类减肥药的研究进展

β3-肾上腺素受体可调节人体热量平衡、葡萄糖代谢、能量消耗并纠正产热不足,可用于治疗肥胖症和2型糖尿病.选择性β3-肾上腺素受体激动剂主要有芳基乙醇胺和芳氧基丙醇胺两类,本文对这些化合物的研究进展进行了综述.     

β3肾上腺素能受体与心力衰竭的研究进展

早期关于β3肾上腺素能受体(B3-adrenergic receptors,B3-AR)的研究主要限于代谢性疾病,近来发现心脏β-AR激动表现为负性肌力作用,这与心力衰竭(heart failure,HF)的发生发展密切相关.本文就β-AR与HF的研究进展作以综述.     

新疆地区鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因研究

目的了解20株鲍曼不动杆菌(A.baumannii,AB)β-内酰胺酶基因存在状况。方法用PCR方法对20株AB菌的9种β-内酰胺酶基因进行检测。结果20株AB菌中blaTEM阳性13株(65%)、blaADC阳性12株(60%)、blaSHV阳性1株(5%),其余β-内酰胺酶基因均阴性;1株blaSHV测得序列经比对为blaSHV-36型;1株blaADC作全长基因测序,测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同,为新亚型。结论该20株AB菌对β-内酰胺类抗生素耐药与产β-内酰胺酶密切相关。     

利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶的结合肽

构建了含有来自于质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的诱饵质粒,利用酵母双杂交系统从随机序列八肽库中进行筛选,通过初筛、复筛验证获得了1个阳性转化子.DNA序列测定结果表明其编码了1段八肽,体内显示具有结合β-内酰胺酶的能力.